5-HT在重癥急性胰腺炎大鼠腸黏膜屏障損傷中作用

［摘要］ 目的

探討發(fā)生重癥急性胰腺炎（SAP）時5-羥色胺（5-HT）在腸黏膜屏障損傷中的作用。

方法 將大鼠隨機分為假手術(shù)組（SO組）、模型組（SAP組）和干預組（SAP+對氯苯丙氨酸（PCPA）組），每組10只。通過膽胰管內(nèi)注射50 g/L牛磺膽酸鈉誘導SAP大鼠模型。SAP大鼠模型構(gòu)建后24 h時檢測各組大鼠血清脂肪酶、淀粉酶、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、5-HT水平以及回腸組織5-HT含量，采用蘇木精-伊紅染色評估胰腺和回腸的形態(tài)學變化，采用Western blot方法和免疫熒光技術(shù)檢測回腸組織緊密連接蛋白（occludin、claudin-1和ZO-1）的表達。

結(jié)果 SAP組大鼠的血清脂肪酶、淀粉酶、TNF-α、IL-6水平以及回腸組織5-HT含量較SO組明顯增高，SAP+PCPA組上述指標較SAP組明顯下降（F=34.54～479.90，P＜0.01）。各組胰腺和腸道損傷病理評分比較，SAP組明顯高于SO組，SAP+PCPA組顯著低于SAP組（F=207.80、33.69，P＜0.01）。SAP組回腸組織中occludin、claudin-1和ZO-1蛋白的表達較SO組顯著減少，SAP+PCPA組上述蛋白的表達較SAP組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義（F=10.29～23.63，P＜0.01）。

結(jié)論 SAP發(fā)生時抑制腸道5-HT的產(chǎn)生可以減輕腸黏膜屏障損傷。

［關(guān)鍵詞］ 血清素；胰腺炎；腸黏膜；緊密連接部

［中圖分類號］ R971.9;R576.1

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0653-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.147

［網(wǎng)絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241029.1619.001;2024-10-30 13：59：21

The role of 5-HT in intestinal mucosal barrier injury in rats with severe acute pancreatitis

WEI Zhongran， LI Tianqi， LI Hongbo， JIANG Yingjian， DU Junjie

（Qingdao University Medical College， Qingdao 266071， China）

［Abstract］Objective To investigate the role of 5-hydroxytryptamine （5-HT） in intestinal mucosal barrier injury in severe acute pancreatitis （SAP）.

Methods Rats were randomly divided into sham-operation group （SO group）， model group （SAP group）， intervention group （SAP+ p-chlorophenylalanine （PCPA） group）， with 10 rats in each group. A rat model of SAP was induced by injecting 50 g/L sodium taurocholate into the biliopancreatic duct. At 24 h after the construction of the rat model of SAP， each group of rats was tested for the levels of serum lipase， amylase， tumor necrosis factor-alpha （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， and 5-HT and the content of 5-HT in the ileal tissue. Morphological changes inthe pancreas and small intestine were evaluated by hematoxylin-eosin staining. Western blot and immunofluorescence techniques were used to determine the expression of tight junction proteins （occludin， claudin-1， and ZO-1） in the ileal tissue.

Results Compared with the SO group， the SAP group had significantly increased levels of serum lipase， amylase， TNF-α， and IL-6 and content of 5-HT in the ileal tissue. Compared with the SAP group， the SAP+PCPA group had significant reductions in the above indices （F=34.54-479.90，Plt;0.01）. The pathological scores of pancreatic and intestinal injury were significantly higher in the SAP group than in the SO group and were significantly lo-

wer in the SAP+PCPA group than in the SAP group （F=207.80，33.69，Plt;0.01）. Meanwhile， the protein expression of occludin， claudin-1， and ZO-1 was significantly lower in the SAP group than in the SO group and was significantly higher in the SAP+PCPA group than in the SAP group （F=10.29-23.63，Plt;0.01）.

Conclusion The production of intestinal 5-HT is inhibited during the development of SAP， which can reduce the intestinal mucosal barrier injury.

［Key words］ serotonin; pancreatitis; intestinal mucosa; tight junctions

重癥急性胰腺炎（SAP）是一種起病快、病死率高的嚴重疾病［1-2］。它常發(fā)生多種并發(fā)癥［3-4］。感染是SAP病人晚期死亡的主要原因［5-6］。已經(jīng)證實，腸黏膜通透性增加導致的細菌易位（BT），是SAP敗血癥和全身感染的主要來源方式［7-10］。而腸黏膜屏障的緊密連接（TJ）在調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能中起著重要作用［11-12］。5-羥色胺（5-HT）作為一種典型的神經(jīng)遞質(zhì)，在整個腸道的生理活動中發(fā)揮著重要作用［13-14］。SAP引起腸黏膜損傷的過程極其復雜，其機制尚未完全闡明。但是目前的研究發(fā)現(xiàn)，在SAP引起的腸黏膜損傷中存在嚴重氧化應激、活性氧（ROS）代謝產(chǎn)物增多等現(xiàn)象，并伴有腸上皮細胞凋亡、鐵死亡的發(fā)生［15-19］。近年來有研究表明，內(nèi)源性5-HT在腸道的釋放可以加重小鼠胰腺炎的進展［20］。在其他胃腸疾病研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制5-HT的合成可以保護腸黏膜屏障［21-22］。但目前尚無5-HT在SAP大鼠腸道TJ屏障損傷中作用的相關(guān)研究，因此本實驗利用5-HT合成抑制劑對氯苯丙氨酸（PCPA）來探究5-HT在SAP大鼠腸黏膜屏障損傷中的作用。

1 材料和方法

1.1 動物分組及處理

實驗選用30只7周齡健康雄性Wistar大鼠（購自青島大學動物中心），體質(zhì)量220～280 g，在實驗室適應性飼養(yǎng)3周。所有大鼠飼養(yǎng)于標準溫度（25±2）℃、相對濕度50%～70%、12 h明暗循環(huán)的環(huán)境中，可自由進食和飲水。將大鼠隨機分為假手術(shù)組（SO組，A組）、模型組（SAP組，B組）和干預組（SAP+PCPA組，C組），每組10只。SAP大鼠模型建立按照文獻方法［23］。干預組大鼠在SAP誘導前24 h腹腔注射PCPA（200 mg/kg）。所有實驗方案均符合美國國立衛(wèi)生研究院《實驗動物指南》的要求，并經(jīng)青島大學動物倫理委員會批準。

1.2 樣本采集

各組大鼠在SAP誘導24 h后再次麻醉，穿刺下腔靜脈采集血樣，離心獲得血清，-80 ℃保存待測。大鼠實施安樂死，采集其胰腺和回腸末端組織，立即將一部分組織固定于40 g/L多聚甲醛中用于制備組織切片，其余組織保存于-80 ℃作進一步檢測分析。

1.3 生化和酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測

使用自動化生化分析儀（Olympus公司）測定血清淀粉酶和脂肪酶水平；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、5-HT的血清濃度和回腸組織5-HT含量使用市售標準化診斷試劑盒（建成生物技術(shù)），按照試劑盒說明書進行測定。

1.4 胰腺和腸道組織病理觀察

各組大鼠胰腺和回腸組織經(jīng)固定、石蠟包埋、切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光鏡下觀察。由兩名病理醫(yī)師根據(jù)有關(guān)文獻的評分標準進行獨立的病理評分［19］。

1.5 Western blot方法檢測大鼠回腸組織TJ蛋白的表達

按照文獻的方法進行檢測［23］，所用occludin、claudin-1以及ZO-1蛋白兔抗體購于三鷹公司，β-actin蛋白兔抗體購于Abways公司。利用Image J軟件進行灰度值分析，以β-actin蛋白為內(nèi)參計算各目的蛋白的表達水平，最后以SO組為標準進行數(shù)據(jù)標準化處理。

1.6 免疫熒光染色觀察回腸組織TJ蛋白的表達

按照文獻方法進行免疫熒光染色［23］，在熒光顯微鏡下觀察大鼠回腸組織中occludin、claudin-1和ZO-1蛋白的表達。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用GraphPad Prism 8軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以±s表示，多組比較采用單因素方差分析和Bonferroni檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) "果

2.1 各組有關(guān)生化指標的比較

SAP組大鼠的血清脂肪酶、淀粉酶、TNF-α、IL-6水平以及回腸組織5-HT含量較SO組明顯增高，SAP+PCPA組上述指標較SAP組明顯下降，差異均有統(tǒng)計學意義（F=34.54～479.90，P＜0.01）；各組血清5-HT水平比較差異無顯著性（P＞0.05）。見表1。

2.2 各組胰腺和腸道組織病理學比較

SO組大鼠胰腺及回腸組織未見明顯損傷；SAP組和SAP+PCPA組大鼠胰腺組織出現(xiàn)出血和脂肪壞死，間質(zhì)水腫，小葉結(jié)構(gòu)紊亂，腺泡細胞廣泛壞死，炎癥細胞浸潤。見圖1。各組大鼠胰腺和腸道損傷病理評分比較，SAP組明顯高于SO組，SAP+PCPA組顯著低于SAP組（F=207.80、33.69，P＜0.01）。見表2。

2.3 各組TJ蛋白表達的比較

Western blot檢測結(jié)果顯示，SAP組回腸組織中occludin、claudin-1和ZO-1蛋白的表達較SO組顯著減少，SAP+PCPA組上述蛋白的表達較SAP組顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（F=10.29～23.63，P＜0.01）。見圖2、表3。免疫熒光染色結(jié)果顯示，與SO組相比，SAP組和SAP+PCPA組TJ蛋白表達水平明顯降低，而SAP+PCPA組TJ蛋白表達水平明顯高于SAP組，與Western blot檢測結(jié)果一致。見圖3。

3 討 "論

SAP是一種發(fā)病急、并發(fā)癥多、病死率高的急型的神經(jīng)遞質(zhì)，在整個腸道的生理活動中發(fā)揮著重要作用，但其在SAP引起的腸黏膜損傷中的作用機制尚未完全闡明，故本實驗利用5-HT合成抑制劑PCPA的干預對此進行了探究。

PCPA可以抑制5-HT合成反應中的限速酶色氨酸羥化酶，進而降低腸道5-HT濃度。有研究表明，腸道內(nèi)源性釋放的5-HT能激活5-HT2A受體，促進胰腺炎小鼠炎癥的進展，并加重小鼠胰腺的損傷［20］。之前有研究已證明，SAP大鼠模型的炎癥在24 h內(nèi)是持續(xù)進展的［19］，因此本實驗選擇在SAP模型建立24 h后收集樣本進行研究。本研究結(jié)果顯示，SAP大鼠腸道組織中5-HT含量較SO組顯

著升高，證明發(fā)生SAP時腸道中的5-HT產(chǎn)生和釋放會明顯增加，這與之前的研究結(jié)果是相同的。本研究中SAP+PCPA組各項炎癥指標水平及腸道損傷病理評分較SAP組顯著降低，表明通過PCPA干預來減少腸道5-HT合成及釋放，會減輕炎癥的程度。同時，本研究Western blot及免疫熒光實驗結(jié)果顯示，SAP+PCPA組與SAP組相比TJ蛋白的表達水平顯著升高，說明腸道5-HT產(chǎn)生減少減輕了腸黏膜屏障損傷，這與在其他胃腸疾病中得到的研究結(jié)論相同［21-22］。

綜上所述，SAP發(fā)生時抑制腸道5-HT的產(chǎn)生可以減輕腸黏膜屏障損傷。雖然這種改善并未能逆轉(zhuǎn)腸道損傷，但我們認為這對于SAP病人安穩(wěn)度過高病死率的急性反應期是有意義的。

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（本文編輯 馬偉平）

［收稿日期］2023-03-06; ［修訂日期］2023-08-26

［基金項目］軍隊后勤科研重點項目（BKJ20J004）

［第一作者］魏鐘燃（1995-），男，碩士研究生。

［通信作者］杜俊杰（1968-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導師。E-mail：dujunjie205@hotmail.com。