基于人類蛋白質組微陣列數據篩選蟾毒靈抗癌作用靶點的生物信息學分析

［摘要］ 目的

通過生物信息學方法分析蟾毒靈人類蛋白質組微陣列數據，探究蟾毒靈互作蛋白之間的潛在聯系，預測蟾毒靈在癌癥中的作用靶點。

方法 使用clusterProfiler包進行GO、KEGG和GSEA富集分析，使用STRING數據庫及Cytoscape軟件進行關鍵蛋白篩選。下載TCGA數據庫數據進行關鍵基因的泛癌分析；使用survival包繪制關鍵基因在肺癌、肝癌和胃癌中的K-M曲線，評估其預后效能。

結果 GO、KEGG和GSEA富集分析結果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白顯著富集于細胞內的各類囊泡的腔和膜以及核糖體等細胞組分，與鳥苷核苷酸結合、GTP結合、鈣黏蛋白結合等分子功能以及氨基酸及衍生物代謝、糖代謝、核糖體、真核細胞翻譯起始、細胞周期、細胞凋亡、DNA復制等生物學過程密切相關。篩選出前10位的核心蛋白，分別為RPL6、RPL8、RPL14、RPL24、RPL31、RPL36、RPS4X、RPS16、FAU和GNB2L1，其中除GNB2L1外均為核糖體蛋白。TCGA數據庫分析結果表明，核心蛋白中的9種核糖體蛋白在大多數癌癥中差異表達且與我國死亡率前3位的癌癥肺癌、肝癌和胃癌的預后密切相關。

結論 蟾毒靈可能通過與核糖體蛋白直接相互作用調控癌細胞中核糖體的組裝與發生，阻礙其蛋白合成從而發揮抑癌作用。

［關鍵詞］ 腫瘤；蟾毒靈；蛋白質陣列分析；計算生物學

［中圖分類號］ R394-33

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2024）05-0639-08

doi：10.11712/jms.2096-5532.2024.60.149

［網絡出版］ https：//link.cnki.net/urlid/37.1517.R.20241101.1536.001;2024-11-04 11：54：49

Bioinformatics analysis for selection of anticancer targets of bufalin based on human proteome microarray data

CHEN Guang， LIU Changying， SONG Qinghang， SUN Fulin， YANG Lina， LI Bing

（Department of Genetics and Cell Biology， Basic Medical College， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

［Abstract］Objective To analyze the human proteome microarray data of bufalin using the bioinformatics method， to explore the potential interactions between bufalin and proteins， and to predict the targets of bufalin in cancer treatment.

Methods

ClusterProfiler package was used for GO， KEGG， and GSEA enrichment analyses. STRING database and Cytoscape software were used to screen for key proteins. Data from TCGA were used for pan-cancer analysis of key genes. The K-M curves of key genes in lung cancer， liver cancer， and gastric cancer were plotted using the survival package to evaluate the prognostic efficacy.

Results

GO， KEGG， and GSEA enrichment analyses showed that the proteins interacting with bufalin were significantly enriched in the cellular components such as lumen and membrane of various vesicles and in ribosome. These proteins were closely related to mole-

cular functions such as guanosine nucleotide binding， GTP binding， and cadherin binding as well as biological processes such as amino acid and derivative metabolism， glucose metabolism， ribosome， eukaryotic translation initiation， cell cycle， apoptosis， and DNA replication. The top ten core proteins were RPL6， RPL8， RPL14， RPL24， RPL31， RPL36， RPS4X， RPS16， FAU， and GNB2L1， which were ribosomal proteins except GNB2L1. Analysis using TCGA database showed that the nine ribosomal core proteins were differentially expressed in most cancers and were closely related to the prognosis of the top three cancers for mortality in China （lung cancer， liver cancer， and gastric cancer）.

Conclusion Bufalin may regulate the assembly and occurrence of ribosomes in cancer cells through direct interaction with ribosomal proteins， which hinders the protein synthesis in cancer cells and thus cancer growth.

［Key words］ neoplasms; bufalin; protein array analysis; computational biology

惡性腫瘤作為全球第二大死亡原因，對人類的健康造成嚴重威脅。在中國，2020年癌癥相關新發病例457萬例，死亡300萬例，分別占全球癌癥發病和死亡的23.7%和30.0%，居世界首位［1］。盡管近

年來癌癥治療手段有所改善，但晚期癌癥的治療仍面臨巨大挑戰［2-4］。因此，國內外學者不斷尋求副作用更小、更加有效的癌癥治療藥物。蟾毒靈是我國名貴中藥蟾酥最有效的抗癌活性成分之一［5-7］。近期研究顯示，蟾毒靈在多種癌癥中具有良好的抗癌作用［8-13］。然而，現已明確的蟾毒靈直接作用靶點仍寥寥無幾。本文使用人類蛋白質組芯片對蟾毒靈潛在的直接作用蛋白進行全面篩選并獲得潛在互作蛋白列表，通過生物信息學方法分析蟾毒靈潛在互作蛋白的細胞組分及參與的生物學過程，并分析其中的核心蛋白及其與癌癥進展及預后的關系。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 人類蛋白質組芯片數據獲取

通過含有23 145個全長人類蛋白質的人類蛋白質組芯片HuProtTM陣列全面篩選蟾毒靈潛在直接互作蛋白。HuProtTM陣列由美國CDI公司制造和提供。通過掃描微陣列信號獲取潛在直接互作蛋白列表，信號強度以信噪比（SNR）進行量化。實驗根據文獻方法進行操作［14］。芯片數據篩選過程由廣州博翀生物科技有限公司完成，獲取SNR＞1.5的蛋白作為潛在互作蛋白。

1.2 GO和KEGG富集分析

使用R語言軟件（4.1.2版本）clusterProfiler包［15］對SNR＞1.5的蛋白進行ID轉換。使用ID轉換包org.Hs.eg.db將SYMBOL轉換為ENTREZID，將物種選擇為Homo sapiens，進而進行GO和KEGG富集分析。結果篩選以調整后P值＜0.05、q值＜0.2為差異有統計學意義。結果使用ggplot2包繪制氣泡圖。

1.3 GSEA富集分析

使用R語言軟件（4.1.2版本）clusterProfiler包［15］對蛋白質組學獲得的所有蛋白進行GSEA富集分析［16］。其中物種選擇為Homo sapiens，參考基因集為Msigdb數據庫中的Hallmarks基因集和C2基因集，均來源于msigdbr包。篩選出標準化富集分數（NES）絕對值＞2、q值＜0.2且P值＜0.05的結果，使用ggplot2包繪制山巒圖和GSEA分析經典圖。

1.4 蛋白-蛋白互作分析

將SNR＞1.5的蛋白輸入STRING數據庫中（https：//string-db.org）獲得蛋白-蛋白相互作用網絡。將該結果輸入cytoscape軟件（3.9.1版本），使用其中cytoHubba插件，Maximal Clique Centrality（MCC）法獲得前10位的關鍵基因。

1.5 基于TCGA數據庫對核心蛋白表達量進行泛癌分析

從TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov）下載33種腫瘤的RNAseq數據并提取TPM格式的數據。使用ggplot2包、stats包及car包進行統計學分析，并繪制獲取的關鍵基因的泛癌表達量箱線圖。

1.6 預后分析

對獲得的關鍵基因繪制肺癌、肝癌和胃癌預后K-M曲線。使用survival包進行比例風險假設檢驗并進行擬合生存回歸，結果用survminer包以及ggplot2包進行可視化［17］。

1.7 統計學分析

使用R軟件（4.1.2）進行統計學分析。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結 "果

2.1 GO和KEGG富集分析

GO分析結果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白顯著富集于細胞內的各類囊泡的腔和膜，如細胞質囊泡腔、晚期內含體和內質網向高爾基體轉運囊泡膜等，以及核糖體等細胞組分。同時，蟾毒靈潛在互作蛋白與鳥苷核苷酸結合、GTP結合、鈣黏蛋白結合等分子功能密切相關（圖1A）。KEGG分析結果表明，蟾毒靈潛在互作蛋白與氨基酸的生物合成以及吞噬體相關生物學過程關系密切（圖1B）。

2.2 GSEA基因集富集分析

GSEA分析結果表明，蟾毒靈潛在直接相互作用蛋白與氨基酸及衍生物代謝、糖代謝、核糖體、真核細胞翻譯起始、NF-κB信號通路、細胞周期、細胞凋亡及DNA復制等生物學過程密切相關（圖2）。同時，對NES＞2的Hallmarks數據集GSEA分析結果顯示，蟾毒靈潛在直接相互作用蛋白與肌肉發生、mTORC1信號通路以及蛋白分泌等過程密切相關（圖3）。

2.3 蛋白-蛋白互作分析

通過STRING數據庫對SNR＞1.5的蛋白進行蛋白-蛋白互作分析顯示，蟾毒靈潛在互作蛋白之間聯系密切，構成了緊密的網絡（圖4A）。使用cytoscape軟件sytoHubba插件MCC方法篩選出了

前10位的核心蛋白，分別為RPL6、RPL8、RPL14、GNB2L1、RPS16、RPL31、RPL24、RPL36、RPS4X和FAU（圖4B）。通過檢索核心蛋白詳細信息，除了GNB2L1外，其余9種核心蛋白均為核糖體大小亞基的組成成分。

2.4 蟾毒靈潛在核心蛋白在泛癌中的表達

基于TCGA數據庫的核心蛋白泛癌表達分析結果顯示，與正常組織相比較，核糖體蛋白RPL6在

大多數癌癥組織中差異表達，其中RPL6在膽管癌（CHOL）、結腸癌（COAD）、食管癌（ESCA）、多形成性膠質細胞瘤（GBM）、腎透明細胞癌（KIRC）、腎乳頭狀細胞癌（KIRP）、肝細胞肝癌（LIHC）、肺腺癌

（LUAD）、肺鱗癌（LUSC）、前列腺癌（PRAD）以及胃癌（STAD）11種癌癥中高表達，在乳腺浸潤癌（BRCA）、宮頸鱗癌和腺癌（CESC）、子宮內膜癌（UCEC）和甲狀腺癌（THCA）4種癌癥中低表達（圖5A）。RPL8在BRCA、CHOL、COAD、ESCA、頭頸鱗狀細胞癌（HNSC）、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、直腸腺癌（READ）、STAD和THCA 15種癌癥中高表達（圖5B）。RPL14在CHOL、COAD、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、PRAD、READ、STAD和THCA 10種癌癥中高表達，而在BRCA、CESC、HNSC、KICH、LUSC和UCEC 6種癌癥中低表達（圖5C）。RPL24在腎上腺皮質癌（ACC）、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、胰腺癌（PAAD）、PRAD、READ、皮膚黑色素瘤（SKCM）、STAD、

睪丸癌（TGCT）、THCA、胸腺癌（THYM）、UCEC和子宮肉瘤（UCS）24種癌癥中高表達，在

急性髓細胞樣白血病（LAML）和卵巢漿液性囊腺癌（OV）中低表達（圖5D）。

RPL31分析顯示，與正常組織相比，RPL31在CHOL、COAD、GBM、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ和STAD 11種癌癥中高表達，而在BRCA、CESC、KICH和UCEC 4種癌癥中低表達（圖5E）。RPL36分析結果顯示，RPL36在ACC、BLCA、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、GBM、KICH、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、腦低級別膠質瘤（LGG）、PAAD、PRAD、READ、STAD、TGCT、THCA、THYM、UCEC和UCS 23種癌癥中高表達。同時，RPL36在ESCA、LAML、OV、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（PCPG）和SKCM 5種癌癥中低表達（圖5F）。RPS4X分析結果如圖5G所示，在ACC、BRCA、CHOL、COAD、DLBC、ESCA、GBM、KIRC、KIRP、LGG、LIHC、LUAD、LUSC、PAAD、PRAD、READ、STAD、THCA、THYM 19種癌癥中高表達；在BLCA、CESC、OV、SKCM和UCEC 5種癌癥中低表達。PRS16分析顯示，與正常組織相比較，RPS16在CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、KIRP、LIHC、LUAD、LUSC、PRAD、READ和STAD 13種癌癥中高表達，而在KICH和UCEC中低表達（圖5H）。FAU分析顯示，與正常組織相比較，FAU在CHOL、COAD、ESCA、GBM、HNSC、KIRC、LIHC和PRAD 9種癌癥中高表達，而在CESC、KICH和UCEC 3種癌癥中低表達（圖5I）。

2.5 蟾毒靈潛在核心蛋白對癌癥診斷和預后影響

蟾毒靈9種潛在核心蛋白對肺癌、肝癌和胃癌預后的影響分析顯示，肺癌中RPL6和RPL8高表達預示著不良的預后（圖6）；在肝癌中，除FAU和RPL31外，其他7種核心蛋白的高表達均與肝癌的不良預后密切相關（圖7）；在胃癌中，RPL24和RPL31表達與胃癌病人的生存期呈反比（圖8）。

3 討 "論

盡管近年來癌癥治療研究突飛猛進，治療手段逐漸多樣化，但晚期癌癥的治療仍然面臨巨大挑戰。蟾毒靈提取于傳統名貴中藥蟾酥，越來越多的研究結果表明，蟾毒靈對肝癌、肺癌和膠質瘤等多種惡性腫瘤具有良好的抑制作用［18-23］。然而，目前對蟾毒靈抑癌作用的機制研究仍不夠深入，其主要原因之一是現已明確的蟾毒靈直接互作蛋白寥寥無幾。尋找蟾毒靈在癌癥中的作用靶點是進一步闡明其抑癌機制的關鍵。

人類蛋白質組微陣列也稱為人類蛋白質組芯片，因其具有高通量、樣品用量少、靈活性強、靈敏度高、結果可直接讀出等諸多優點，迅速發展成為藥物靶點及腫瘤生物標志物篩選等領域的明星技術［24］。本課題組利用人類蛋白質組微陣列全面篩選了蟾毒靈潛在直接互作蛋白，首先對人類蛋白質組微陣列結果列表中SNR＞1.5的蛋白進行了GO、KEGG和GSEA富集分析，結果表明蟾毒靈潛在直接互作蛋白與核糖體組裝及蛋白質合成高度相關。這提示蟾毒靈可能靶向這些潛在直接相互作用蛋白調節核糖體組裝及蛋白質合成過程發揮藥理作用。接著，本研究通過蛋白-蛋白互作分析篩選出排前10位的核心蛋白。通過檢索核心蛋白的信息發現，這10種核心蛋白中的9種（RPL6、RPL8、RPL14、RPS16、RPL31、RPL24、RPL36、RPS4X和FAU）均為核糖體蛋白，它們是核糖體大小亞基的組成部分。結合之前富集分析結果，推測蟾毒靈可能通過靶向這些直接互作蛋白參與核糖體的組裝，并影響后續細胞蛋白合成從而發揮對癌癥的抑制作用。

為了進一步探究9種核心蛋白作為蟾毒靈作用靶點的可行性，本文通過TCGA數據庫對其在泛癌中的表達量進行了分析。結果表明，與正常組織相比，9種核心蛋白在多種癌癥中存在差異表達，提示這些潛在的核心蛋白在癌癥的發生發展中發揮重要作用。同時，通過對數據庫中病人的臨床資料分析表明，RPL6、RPL8、RPL14、RPS16、RPL24、RPL36和RPS4X在肝癌中，RPL24和RPL31在胃癌中以及RPL6和RPL8在肺癌中的高表達預示著不良的預后。這表明蟾毒靈潛在直接結合蛋白的核心蛋白與癌癥的預后，尤其是肝癌的預后密切相關。

核糖體組裝和生物發生異常與腫瘤發生之間聯系密切［25-26］。癌細胞生長和增殖需要更多的蛋白合成，這依賴于過度活躍的核糖體生物發生［27］。越來越多的證據表明，核糖體蛋白表達的失調與癌癥進展及治療耐藥高度相關，其中涉及多種生物學過程，包括細胞周期、DNA修復、基因組完整性的維持、細胞增殖、細胞凋亡、自噬、細胞遷移和侵襲［28-30］。相關研究表明，RPL6表達水平升高提高了胃癌細胞的增殖能力和多藥耐藥性［31-32］，沉默RPL8的表達能夠促進肝癌細胞凋亡并抑制肝癌進展［33］，RPS4X表達上升能夠促進肝癌的發生和轉移［34］，而RPL14在鼻咽癌中被認為是一種抑癌因子［35］。這些結果為蟾毒靈通過調節眾多生物學過程抑制癌癥進展給出了一個合理的解釋。因此，蟾毒靈可能通過靶向核糖體蛋白抑制核糖體組裝和發生，阻礙癌細胞的蛋白合成從而發揮抑癌作用。這需要進一步的實驗進行驗證。

此外，本文GO、KEGG和GSEA富集分析結果還顯示，蟾毒靈潛在結合蛋白與氨基酸及衍生物代謝、糖酵解、細胞周期、細胞凋亡、DNA復制以及鈣黏蛋白結合等生物學過程密切相關，且參與調控NF-κB和mTORC1等信號通路。提示蟾毒靈抑癌機制可能為：①蟾毒靈可能通過靶向與氨基酸合成、鳥苷核苷酸結合相關的蛋白阻礙癌細胞DNA的復制，使癌細胞周期停滯從而抑制癌細胞增殖，激活細胞程序性死亡；②高水平的糖酵解是許多癌癥的共同屬性（Warburg效應）［36］，蟾毒靈可能通過靶向與糖酵解相關的蛋白抑制癌細胞的糖酵解從而發揮對癌癥的抑制作用；③上皮-間充質轉化（EMT）在癌癥的轉移中發揮重要作用，而鈣黏蛋白的表達變化是EMT的重要標志［37］，蟾毒靈可能靶向與鈣黏蛋白結合相關蛋白抑制癌細胞EMT的發生從而抑制癌癥的發生和發展。

綜上所述，蟾毒靈直接互作蛋白顯著富集于核糖體組裝與發生以及蛋白質合成，直接互作蛋白中位于核心的蛋白主要為核糖體蛋白，這些核心蛋白在多種癌癥中差異表達并與預后密切相關。蟾毒靈可能通過與核糖體蛋白直接相互作用調控癌細胞中核糖體的組裝與發生，阻礙其蛋白合成從而發揮抑癌作用。本研究為蟾毒靈的作用機制研究提供了合理的思路，為其作為一種有前景的臨床抗癌藥物奠定了基礎。

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（本文編輯 黃建鄉）

［收稿日期］2023-03-23; ［修訂日期］2023-06-17

［基金項目］國家自然科學基金資助項目（81803895，818712-31）；山東省自然科學基金資助項目（ZR2021YQ57）

［第一作者］陳光（1996-），男，碩士研究生。

［通信作者］李冰（1980-），女，博士，教授，博士生導師。E-mail：libing_516@qdu.edu.cn。楊麗娜（1985-），女，博士，副教授，碩士生導師。E-mail：yanglina@qdu.edu.cn。