丹皮酚對大腦中動脈缺血模型小鼠行為功能障礙的改善作用研究

【摘要】 背景 中風是嚴重危害人體健康的心腦血管系統疾病之一，具有高患病率、高致殘率和高致死率的特征。牡丹皮是毛茛科植物牡丹干燥根皮，具有清熱涼血、活血化瘀之功效。丹皮酚是牡丹皮的主要活性成分，已有研究證實在缺糖缺氧條件下，丹皮酚對神經元有一定保護作用。目的 觀察丹皮酚對大腦中動脈缺血（MCAO）模型小鼠的干預效果，探究丹皮酚溶液灌胃在治療中風行為功能障礙的神經生物學機制。方法 本研究時間為2019年12月—2021年12月。缺血性中風模型的建立與評價：將20只SPF級雄性C57BL/6小鼠，采用隨機數字表法分成假手術組（n=10）、模型組（MCAO組，n=10），采用線栓法制成小鼠MCAO模型，造模24 h后，通過Longa評分評價各組小鼠神經功能受損情況；激光散斑血流成像系統監測各組小鼠在MCAO術后大腦血流改變狀況；對MCAO術后的小鼠進行TTC染色，在病理上觀察小鼠大腦的損傷情況。探究丹皮酚對MCAO小鼠的行為功能保護作用：將50只SPF級、雄性C57BL/6小鼠進行隨機分組：假手術組（n=10）、模型+玉米油組（n=20）、模型+丹皮酚組（n=20）。造模后24 h，驗證模型穩定后，模型+丹皮酚組用丹皮酚玉米油溶液灌胃，給藥濃度為100 mg·kg-1· d-1，其余組灌服等量玉米油。在造模28 d后，統計三組小鼠的存活情況，繪制生存曲線；使用Longa評分判斷小鼠神經功能恢復情況；尼氏染色法檢測小鼠大腦梗死面積；行為學測試小鼠在造模前及造模后7、14、21、28 d 5個時間點的運動感覺功能改變。探究丹皮酚對MCAO小鼠行為功能改善的機制：隨機將30只SPF級、雄性C57BL/6小鼠分成假手術組（n=6）、模型+玉米油組（n=12）、模型+丹皮酚組（n=12）。造模后24 h，驗證模型穩定后，藥物組用丹皮酚玉米油溶液灌胃，給藥濃度為100 mg·kg-1·d-1，其余組灌服等量玉米油。造模后2 d，用Western blotting法測定小鼠大腦紋狀體白介素1β（IL-1β）蛋白表達情況，探究急性期內丹皮酚是否能降低大腦炎性反應；造模后14 d，采用免疫熒光法檢測小鼠大腦半暗帶離子鈣結合銜接分子1（IBA1）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）的表達。結果 模型+玉米油組小鼠干預28 d的生存率為66.47%，丹皮酚組小鼠生存率為81.43%。Log-rank檢驗結果顯示，三組小鼠干預28 d的生存曲線比較，差異有統計學意義（χ2=1.436，Plt;0.05）。造模28 d后，模型+丹皮酚組Longa評分低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平高于假手術組（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平高于假手術組（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平低于模型+玉米油組（Plt;0.05）。結論 丹皮酚可控制MCAO模型中小鼠在急性階段的發癥反應，減少了小鼠急性腦梗死面積，延長了小鼠生存期、改善了其運動感覺功能。

【關鍵詞】 腦缺血；大腦中動脈缺血；丹皮酚；離子鈣結合銜接分子1；膠質纖維酸性蛋白；白介素1β；功能障礙

【中圖分類號】 R 743.31 【文獻標識碼】 A DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0346

【引用本文】 陳茜，駱建宇，鄺棗園，等. 丹皮酚對大腦中動脈缺血模型小鼠行為功能障礙的改善作用研究［J］. 中國全科醫學，2023，26（27）：3441-3449. DOI：10.12114/j.issn.1007-9572.2022.0346.［www.chinagp.net］

【Abstract】 Background Stroke is a cardiovascular disease that seriously endangers human health，which is characterized by high prevalence，disability and mortality rates. Peony bark is the dried root bark of peony in the buttercup family，which has the effect of clearing heat and cooling blood，activating blood circulation and resolving blood stasis. Paeonol（PAE） is the main active ingredient of peony bark，has been confirmed to have neuroprotective effect under hypoglycemia and hypoxia conditions. Objective To observe the effect and neurobiological mechanism of gastric administration of paeonol solution on improving behavioral dysfunction caused by middle cerebral artery occlusion （MCAO），a kind of stroke，in a mouse model. Methods The study was conducted from December 2019 to December 2021. Twenty SPF male C57BL/6 mice were randomized into SHAM group （n=10） and model group （MCAO group，n=10）. The MCAO model was formed by intraluminal suture method. After 24 hours of modeling，the neurological function of each group was evaluated by Longa Score. Laser Speckle Contrast Imaging was used to monitor the changes of cerebral blood flow after MCAO. TTC staining was used in the pathological examination of cerebral infarction in MCAO mice. For investigating the protective effect of PAE on behavioural dysfunction of MCAO mice，50 SPF male C57BL/6 mice were randomly grouped into SHAM group （n=10），model+corn oil group （n=20），and model+PAE group （n=20）. After the verification of model stability at 24 hours following the modeling，the model+PAE group received intragastric administration of PAE and corn oil solution in a concentration of 100 mg·kg-1· d-1，and the other two groups were gavaged with equal amounts of corn oil. Then on the 28th day after of modelling，survival curve was plotted to assess the survival status of mice in the three groups；the neurological recovery of mice was determined using the Longa Score；the area of cerebral infarction was examined by Nissl staining. The behavioural changes in motor sensory function were tested at five time points：the day before modeling，and 7，14，21 and 28 days after modelling. For exploring the mechanism of PAE improving behavioural dysfunction in MCAO mice，30 SPF male C57BL/6 mice were randomly divided into SHAM group （n=6），model+corn oil group （n=12） and model+PAE group （n=12）. After verifying the model stability at 24 hours following the modeling，the model+PAE group received intragastric administration of PAE and corn oil solution in a concentration of 100 mg·kg-1· d-1，and the other two groups were gavaged with an equal amount of corn oil. The expression of interleukin 1β（IL-1β） protein in the striatum of mouse brain was measured by Western blotting on the second day after modelling to investigate whether PAE could reduce the inflammatory response in the brain during the acute period. The expression of ionized calcium-binding adapter molecule 1 （IBA1） and glial fibrillary acidic protein （GFAP） in the penumbra was measured by immunofluorescence on the 14th day after modelling. Results The 28-day survival rate was 66.47% for the model+corn oil group，and 81.43% for model+PAE group. Log-rank test showed that the 28-day survival curve significantly differed across SHAM group，model+corn oil group，and model+PAE group（χ2=1.436，Plt;0.05） The Longa Score was lower in model+PAE group than in model+corn oil group on the 28th day after modelling（Plt;0.05）. The differences in the expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues of the three groups were statistically significant （Plt;0.05）. Specifically，the expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues in SHAM group were lower than those of the other two groups （Plt;0.05）. The expression levels of IBA1 and GFAP in brain tissues in model+PAE group were lower than those in model+corn oil group （Plt;0.05）. On the second day after modelling，model+corn oil group had higher expression level of IL-1β in striatum than both SHAM group and model+PAE group （Plt;0.05）. Conclusion PAE could control the inflammatory response in the acute stage，reduce the area of acute cerebral infarction，prolong the survival time and improve the motor sensory function in the mouse model of MCAO.

【Key words】 Brain Ischemia；Middle cerebral artery occlusion；Paeonol；Ionized calcium binding adapter molecule 1；Glial fibrillary acidic protein；Interleukin 1β；Dysfunction

中風是嚴重危害人體健康的心腦血管系統疾病之一，其中，缺血性腦血管病（ischemic cerebrovascular disease，ICVD）約占所有中風的80%，具有高患病率、致殘率和致死率等特征，而中老年人群則是傷殘和死亡群體中的重點研究對象［1］。

丹皮酚為毛茛科植物牡丹的干燥根皮（牡丹皮）和蘿藦科鵝絨藤屬植物徐長卿的干燥根及根莖中的主要活性成分。一項腦組織缺血再灌注小鼠模型研究發現，丹皮酚能夠降低腦梗死面積［2］。有研究認為，丹皮酚能夠對抗神經系統炎癥、抑制氧自由基的產生［3］，在缺糖、缺氧的條件下，丹皮酚對神經元有保護作用［4］。上述研究表明丹皮酚很可能是一類極有前景的神經保護劑。本研究旨在通過觀察丹皮酚對大腦中動脈缺血（MCAO）模型小鼠的干預效果，從而明確丹皮酚在缺血性中風治療中的作用，具體實驗方法及結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與時間 SPF級C57BL/6雄性小鼠100只，體質量23～28 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（粵）2019-0047。小鼠均飼養于廣州中醫藥大學華南針灸實驗中心，12 h光照、黑暗交替，室溫23～25 ℃，相對濕度50%～60%。造模前適應性喂養1周，食水自由。本實驗通過廣州中醫藥大學實驗動物倫理審查（審查批號：20190307034），實驗操作均嚴格按照廣州中醫藥大學倫理委員會實驗動物操作執行。本研究時間為2019年12月—2021年12月。

1.2 實驗藥品和試劑 丹皮酚粉末（上海源葉生物科技有限公司，貨號：S24511），玉米油（SIGMA公司，貨號：C8267），兔抗大鼠離子鈣結合銜接分子1（IBA1）單克隆抗體（Wako公司，貨號：019-19741），大鼠膠質纖維酸性蛋白（GFAP）單克隆抗體（Thermo Fisher公司，貨號：13-0300），小鼠白介素（IL）-1β單克隆抗體（CST公司，貨號：12242S）；2，2，2-三溴乙醇（SIGMA公司，貨號：T48402-5G），動物用異氟烷（Reward公司，貨號：R510-22-10）；其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器 動物實時激光散斑灌注成像儀（Perimed AB），動物維持麻醉系統（Reward公司），高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技公司），冰凍切片機（賽默飛世爾科技公司），共聚焦顯微鏡（Nikon），基礎電泳儀電源（Bio Rad），小型轉印槽（Bio Rad），正置熒光顯微鏡 （Nikon），凝膠成像分析系統（Bio Rad），硅膠線栓（北京西濃科技有限公司）。

1.4 制備模型及驗證模型穩定性

1.4.1 MCAO模型制備 采用隨機數字表法隨機將20只C57/BL6小鼠隨機分為MCAO模型組、假手術組，每組各10只。參照Zea Longa線栓法［5］進行MCAO模型制備。使用小動物氣體麻醉系統、2%異氟烷維持麻醉，以仰臥位方式固定，頸下正中切開，沿正中線分離鼓泡腺體，找到頸總動脈以彎鑷做鈍性分離，分離迷走神經，頸總動脈近心端穿6-0絲線并結扎，向上分離，尋找頸總左側分叉，作鈍性分離并結扎頸外動脈，用毛細血管夾夾閉頸內動脈，頸總動脈遠心端穿6-0絲線暫不結扎，血管剪15°～45°剪開勁總動脈，插入線栓，結扎遠心端線結后打開血管夾，線栓順血管插入至威利斯環。假手術組除不置入線栓外，其他過程均同MCAO模型小鼠。小鼠在清醒后進行Longa評分，評分2～3分為造模成功，1ｈ后拔出線栓完成造模。凡由于其他因素而造成的動物數量低于實驗各組預定數量時，均采用隨機抽樣原則補齊所需要的實驗動物數量。

1.4.2 神經功能損害評分觀察行為學以驗證模型成功 造模后24 h，對動物模型進行評分，Longa評分2～3分者認為滿足要求，可進行實驗研究。對不滿足判斷標準的小鼠進行實驗剔除。麻醉后未蘇醒者認為造模失敗，相關神經功能損傷評分情況，見表1。

1.4.3 激光散斑灌注成像檢測梗死側腦血流灌注情況以驗證模型穩定性 造模后24 h，參照PAUL等［6］方法，利用激光散斑灌注成像技術觀察MCAO模型小鼠梗死側腦血流變化。采用隨機數字表法，將10只小鼠隨機分為假手術組與MCAO組，每組各5只，于造模后24 h，將各組小鼠用1.25%的三溴乙醇溶液麻醉后俯臥位固定于腦立體定位儀上，剃去頭部毛發，消毒后從頭部正中剪開頭皮暴露顱骨，用波長為671 nm的激光照射顱骨上，相機芯片上形成血管的動態散斑圖（操作距離

11.6 cm，成像面積直徑87 mm2，曝光-時間 60 s，2張圖像/s，分辨率單位0.035 mm），采用PIMSoft程序計算感興趣區域（ROI）的均值作為灌注量。

1.4.4 TTC染色觀察小鼠大腦梗死部位及面積 造模后24 h，隨機選取3只小鼠，使用1.25％的三溴乙醇溶液進行腹腔注射（注射劑量0.1 mL/10 g小鼠），麻醉后頸椎脫臼處死，剝離大腦后迅速置于小鼠腦模具中，于-20 ℃冰箱冰凍20 min。切去嗅球與小腦部分，利用模具將鼠腦切成厚度為1 mm的腦片。將切好的腦片放入配制好的1％TTC溶液中，并置于37 ℃水浴鍋中避光加熱，15 min后觀察腦片顏色變化并記錄。

1.5 探究丹皮酚對MCAO模型小鼠行為功能的改善作用

1.5.1 實驗分組與給藥 采用隨機數字表法對50只小鼠進行分組，模型+丹皮酚組、模型+玉米油組各20只，假手術組為10只。模型+丹皮酚組、模型+玉米油組28 d內存活下來的小鼠數量各9只，假手術組為10只。

模型+丹皮酚組：MCAO造模成功24 h后灌服丹皮酚玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1（丹皮酚玉米油溶液濃度為40 mg/mL）。

模型+玉米油組：MCAO造模成功24 h后灌服玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1。

假手術組：術后24 h灌服玉米油溶液100 mg·kg-1·d-1。

于造模后28 d內對各組小鼠的存活狀況情況予以統計，繪制生存曲線，采用Longa評分法對小鼠進行神經功能評分。

1.5.2 尼氏染色法檢測小鼠腦組織病理損傷程度 用藥后28 d，各組小鼠分別取5只，麻醉后取腦，4％多聚甲醛溶液（PFA）4 ℃固定過夜。然后依次置于15%、30%蔗糖溶液中梯度脫水，Thermo冰凍切片機切片，厚度為40 μm。腦片置于70%乙醇浸泡4 h；超純水浸洗2次；固定后晾干，用尼氏染液（焦油紫法）染色20～30 min；超純水浸洗2次；95%乙醇脫色2次；無水乙醇脫色；二甲苯透明2次；晾干后用中性樹膠封片，采用Nikon正置光學顯微鏡拍照，觀察腦組織病理損傷程度。比較三組小鼠健側大腦面積/患側大腦面積系數。

1.5.3 行為學實驗評估小鼠運動感覺功能 （1）走格子測試：主要用于評價實驗小鼠在自發運動過程中的運動感覺協調性功能［7］。評估時小鼠被安置在距離桌面高30 cm、長35 cm、寬30 cm的金屬網格上，網格的孔寬度為1.5 cm。讓小鼠在網格上自由爬行5 min。在網格下，利用視頻采集設備記錄小鼠的爬行過程。如果小鼠指爪未抓住網格而踩空即為一次錯步。小鼠在黑暗環境下自由行走并開始計時，通過視頻慢放來計數小鼠在黑暗網格中100步內的右側肢體錯步次數，計算錯步占百步的百分比為踩空率。MCAO造模前3 d為適應訓練，每天將小鼠放置在金屬網格架上自由爬動2 min，消除小鼠的焦慮情緒。造模前采集最后1次適應活動的視頻，并分析錯步率以作為基線數據。三組小鼠造模后第7、14、21、28天各評估1次，并采集視頻分析踩空率。

（2）爬杯測試：用于評估小鼠前肢使用不對稱性［8］。造模前3 d為適應性階段。小鼠被放置在直徑9 cm、高15 cm的透明有機玻璃圓筒中隨意活動，當其后肢佇立起身爬杯次數達10次后方可拎出，5 min內后肢站立起身次數lt;10次的小鼠將放回籠中自由活動10 min后再進行實驗，直至完成10次爬杯。三組小鼠造模后第7、14、21、28天時，將小鼠安置在圓筒中隨意活動，在圓筒前約10 cm處安裝視頻采集設備記錄小鼠活動狀況，并利用視頻慢放來計數小鼠用后肢站立時用右前爪接觸筒壁的總次數，以及因無力觸穩杯壁而出現右前爪劃拖的次數，拖爪次數/觸壁總次數×100％=拖爪率。每輪小鼠實驗完畢后均需用乙醇消毒圓筒，確保圓筒無異味，不影響其他小鼠的測試。

（3）患側前肢剝離粘紙測試：用于評估小鼠前肢運動感覺功能［9］。將0.3 cm×0.4 cm的粘紙貼于小鼠右前爪掌心。將小鼠放在直徑20 cm的透明有機玻璃圓杯中，小鼠首次對粘紙做出反應的時間（如甩動右爪、用嘴接觸粘紙等）為感覺粘紙時間。造模前3 d根據以上步驟進行自適應培訓，將最后1 d的數據視為基線數據，在造模后第7、14、21、28天均進行2輪測試并取最優值。

1.6 丹皮酚對MCAO小鼠行為功能改善的機制分析

1.6.1 實驗分組與給藥 隨機將30只SPF級雄性C57BL/6小鼠分成假手術（SHAM）組6只，術后存活6只；模型+玉米油（MCAO+oil）組、模型+丹皮酚（MCAO+PAE）組各12只，術后存活各11只，給藥方式以及藥物濃度同1.5.1。

1.6.2 免疫熒光法檢測腦組織中IBA1、GFAP表達水平 于造模后14 d，模型+玉米油組、模型+丹皮酚組各取5只小鼠，假手術組取3只小鼠。將小鼠用1.25％三溴乙醇溶液麻醉后取腦，4％PFA于4 ℃固定12 h。然后依次置于15%、30%蔗糖溶液中脫水，用冰凍切片機切片（厚度為40 μm）。腦片用封閉液（2.5%羊血清、2.5%驢血清和0.3% Triton X-100，溶于PBS，pH值為7.4）封閉1 h，滴加一抗（IBA1、GFAP抗體均為1∶1 000稀釋），4 ℃過夜孵育，次日，PBS洗滌后滴加熒光二抗（1∶2 000），避光于室溫下孵育2 h。經PBS洗滌后，滴加4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（1∶2 000），染色10 min后用PBS清洗，最后用含甘油的PBS溶液作為封片劑進行封片，于熒光顯微鏡下觀察小鼠腦損傷側冰凍切片，在相同的放大倍數及參數下，分別隨機選取每張腦片梗死中心區以及半暗帶區3個視野照相。

1.6.3 Western blotting法檢測紋狀體白介素1β（IL-1β）蛋白表達水平 于造模后2 d，模型+玉米油組、模型+丹皮酚組各取6只小鼠，假手術組取3只小鼠。斷頸處死小鼠后取腦，冰上操作，分離其紋狀體，用RIPA裂解緩沖液（含有1∶50蛋白酶磷酸酶抑制劑）提取紋狀體中的蛋白質。然后加入1×loading buffer進行配平，使各樣本濃度均為2 μg/μL。將蛋白質提取物于55 ℃下煮沸20 min，加樣（2μL/泳道）到10％凝膠上。室溫下采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，然后將凝膠轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。使用5％牛血清白蛋白（BSA）封閉液室溫封閉PVDF 1 h，孵育一抗，搖床過夜。然后室溫下孵育二抗1.5 h，使用TBST漂洗3次，固定顯影成像后用Image J軟件進行分析。

1.7 統計學方法 采用Graphpad Prism 7.0軟件進行數據分析和圖片制作。計量資料經Shapiro-Walk檢驗判斷是否符合正態分布，符合者多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同時間點多組間比較采用多因素重復測量方差分析。不符合正態分布的數據以M（P25，P75）表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，組間兩兩比較采用Bonferroni檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 模型制備與驗證模型穩定性

2.1.1 造模24 h后神經功能缺損情況比較 造模后2 h，假手術組小鼠Longa評分為0分，MCAO模型小鼠Longa評分為2.0（2.0，2.0）分。

造模后24 h，將MCAO模型小鼠吊起懸空，發現小鼠右前爪向腹側蜷縮（圖1），自由活動時軀體不自主地向患側轉圈，或行走時向患側傾斜，Longa評分為2～3分。

2.1.2 造模后24 h激光散斑灌注成像檢測梗死側腦血流灌注情況 造模后24 h，假手術組小鼠梗死側平均腦血流灌注量為（223.6±9.7），MCAO模型小鼠為（144.0±15.9）；造模后24 h MCAO模型小鼠梗死側平均腦血流灌注量小于假手術組，差異有統計學意義（t=9.54，Plt;0.01）。MCAO模型小鼠大腦中動脈區血供異常，左右兩側腦血流灌注圖見圖2。

2.1.3 造模24 h后TTC染色評估MCAO模型小鼠大腦梗死部位及面積 在小鼠大腦中動脈缺血1 h再灌注24 h后對其大腦切片進行TTC染色，可觀察到未梗死部位呈暗紅色，梗死部位表現為發白，部位集中在患側紋狀體與皮質，見圖3。

2.2 丹皮酚對MCAO模型小鼠行為功能的改善作用

2.2.1 三組小鼠28 d內生存期比較 模型+玉米油組小鼠干預28 d的生存率為66.47%，模型+丹皮酚組小鼠生存率為81.43%。Log-rank檢驗結果顯示，三組小鼠干預28 d的生存曲線比較，差異有統計學意義（χ2=1.436，Plt;0.05），見圖4。

2.2.2 三組小鼠造模后28 d Longa評分比較 三組小鼠造模后28 d Longa評分比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；造模28 d后，模型+玉米油組Longa評分高于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組與假手術組Longa評分比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05）；模型+丹皮酚組Longa評分低于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表2。

2.2.3 三組小鼠造模后28 d健側大腦面積/患側大腦面積系數比較 三組小鼠造模后28 d健側大腦面積/患側大腦面積系數比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后28 d健側大腦面積/患側大腦面積系數大于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后28 d健側大腦面積/患側大腦面積系數小于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表3。

假手術組小鼠腦部切片左右腦片形狀對稱，皮質神經元構造形態正常，排列有序，尼氏小體數量豐富，染色水平一致，呈現深藍紫色，未見病理性損傷。與假手術組比較，模型+玉米油組小鼠大腦梗死處中樞神經元發生嚴重萎縮變形，腦組織的內部結構也遭到了損害，患側大腦萎縮，見圖5。

2.2.4 各組小鼠運動感覺功能比較 組間與時間對小鼠走格子測試踩空率存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時間分別為小鼠走格子測試踩空率主效應顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后7、14、21、28 d走格子測試踩空率高于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14 d走格子測試踩空率高于假手術組，造模后7、14、21、28 d走格子測試踩空率低于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表4。

組間與時間對小鼠爬杯試驗拖爪率存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時間分別為小鼠爬杯試驗拖爪率主效應顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21、28 d爬杯試驗拖爪率高于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21、28 d爬杯試驗拖爪率低于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表5。

組間與時間對小鼠感覺粘紙時間存在交互作用（Plt;0.05）；組間及時間分別為小鼠感覺粘紙時間主效應顯著（Plt;0.05）。模型+玉米油組小鼠造模后7、14、21、28 d感覺粘紙時間長于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7、14、21 d感覺粘紙時間短于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后7 d感覺粘紙時間長于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表6。

2.3 丹皮酚對MCAO小鼠行為功能改善的機制

2.3.1 三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平比較 三組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組、模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平高于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后14 d腦組織中IBA1、GFAP表達水平低于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表7、圖6。

2.3.2 三組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平比較 三組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平比較，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+玉米油組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平高于假手術組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；模型+丹皮酚組小鼠造模后2 d紋狀體IL-1β蛋白表達水平低于模型+玉米油組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見表8、圖7。

3 討論

臨床上，大多數人類缺血性梗死發生在大腦中動脈區域［10］，因此，為了更好地在實驗動物中模擬人類大腦缺血性疾病，本實驗選擇了MCAO模型進行研究。實驗結果證明，建造MCAO模型后，小鼠顱內存在明顯的梗死病灶，中樞神經行為嚴重受損，腦組織的內部結構越來越薄和稀松，腦內神經元皺縮嚴重；丹皮酚治療后，MCAO模型小鼠中樞神經系統損害情況較之前好轉，干預28 d的生存率明顯提高，前肢運動感覺協調功能及前肢非對稱性運動功能均顯著提高，與腦梗死體積結果一致，說明丹皮酚能在一定程度上緩解這些損害，對MCAO模型小鼠的行為和感覺功能有明確的改善作用。

缺血性中風后梗死區可劃分為核心區和缺血半暗帶區，核心地帶的周邊缺血性腦組織為缺血半暗帶，而缺血暗帶區則為發生氧化應激、自由基損害的主要部位，為腦灌注量介于電活動失常與不可逆神經元去極化之間的狀態區域［11］，其神經元表現為凋亡。半暗帶的概念已經成為中風研究中的一個里程碑，因為半暗帶基本上是可以挽救的，減小半暗帶區神經元損傷是神經保護的重要方法［12］。小膠質細胞也是中樞神經網絡系統（CNS）重要的機體免疫組成部分［13］，中風后不斷被激活的小膠質細胞可產生炎性因子，造成神經炎性反應的惡性循環，因此炎性反應是中風后突出的表現，小膠質細胞也已被證明是動物模型腦缺血早期神經元損傷的敏感指標［14］。星狀膠質神經元廣泛存在于人腦灰質和白質中，在神經元的發育、突觸傳導、神經組織修復和再生、神經系統免疫功能和各種神經系統疾患的病理機制等方面均起到了重要的作用。IBA1和GFAP分別為小膠質細胞和星形膠質細胞的標記物，其是反應中樞神經系統損傷程度的標志性物質。本研究結果顯示，丹皮酚造模后小鼠腦組織半暗帶區內IBA1、GFAP表達均下調，說明星形膠質細胞和小膠質細胞應激程度降低，這表明丹皮酚可能在緩解缺血性中風模型腦內炎性反應具有一定的療效。

缺血再灌注引起炎性反應，其特征是腦內各種細胞因子的局部表達，IL-1β在腦缺血1 h后即可被檢測到，且已被認為可以誘導神經元損傷。IL-1β作為最早確認的神經肽的細胞因子，是一種前炎性細胞因子，其生成與Toll樣受體（TLR）、Nod樣受體（NLRs）家族、RIG-I樣受體（RLRs）家族、C型凝集素受體家族這幾種模式識別受體相關，由神經系統的內皮細胞、神經膠質細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元合成［15］。研究表明，實驗性中風后IL-1β表達顯著上調［16］，而丹皮酚通過阻斷TLR4/髓樣分化因子88（myeloid differentiationfactor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路傳導，抑制小鼠血清IL-1β水平［17］。本研究利用Western blotting法檢測MCAO小鼠損傷側紋狀體IL-1β蛋白表達水平，發現其在模型+丹皮酚組較模型+玉米油組明顯降低，說明丹皮酚可以有效降低小膠質細胞的激活，下調IL-1β的表達，減少炎性反應，使小鼠存活率上升，腦梗死面積減少，運動感覺功能改善。

綜上所述，本研究著重探討丹皮酚對線栓缺血性中風模型行為學功能障礙的效果和相關生物學機制。從分子、病理、行為學不同層次系統的研究丹皮酚改善缺血性中風行為功能障礙，為丹皮酚的臨床應用提供參考。

作者貢獻：許沁提出研究思路，確定模型的選擇；陳茜負責小鼠模型制作、負責各種實驗、對樣本進行采集、收集相關數據、進行統計學分析和繪制圖表，負責論文起草最終版本修訂，對論文負責；駱建宇負責行為學實驗，負責行為學數據的采集和統計學分析；鄺棗園設計研究方案，研究命題的提出、設計。

本文無利益沖突。

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（收稿日期：2022-03-06；修回日期：2022-11-11）

（本文編輯：毛亞敏）