miR-181c-5p通過靶向N-myc下游調控基因2調控人膠質母細胞瘤生物學行為機制研究

【摘要】目的 探討miR-181c-5p通過靶向N-myc下游調控基因2（NDRG2）調控人膠質母細胞瘤生物學行為的機制。方法 選取2021年4月至2022年4月海南省第二人民醫院收治的30例非功能區膠質瘤患者術中的膠質母細胞瘤（GBM）組織標本及鄰近正常腦組織標本進行研究。應用實時定量聚合酶鏈式反應（qRT-PCR）檢測GBM組織標本、正常腦組織標本中miR-181c-5p的表達水平；熒光素酶檢測 miR-181c-5p 靶向調控NDRG2基因情況；應用qRT-PCR及免疫印跡試驗（Western Blot）檢測GBM組織標本中 NDRG2 的基因及蛋白表達水平；檢測GBM細胞增殖、遷移和侵襲情況。結果 GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量高于正常組織標本（Plt;0.05）；雙熒光素酶實驗顯示，miR-181c-5p模擬物（miR-181c-5p mimics）組NDRG2野生型（NDRG2 WT）的相對熒光素酶活性低于模擬物對照（NC-mimics）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p抑制劑（miR-181c-5p inhibitor）組U87細胞中NDRG2 mRNA表達和蛋白表達高于抑制劑對照（NC-inhibitor）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p mimics組U87細胞中NDRG2 mRNA 表達和蛋白表達顯著低于NC mimics組（Plt;0.05）；細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）檢測結果顯示，轉染sh-NDRG2（sh-NDRG2）組U87細胞增殖率低于轉染sh-NC（sh-NC）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2組U87細胞增殖率低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組（Plt;0.05）。Transwell 實驗顯示，sh-NDRG2組U87細胞遷移數量及侵襲數量低于sh-NC組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2組U87細胞遷移數量及侵襲數量低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組（Plt;0.05）。結論 miR-181c-5p能夠通過調節NDRG2的表達，進而調節人膠質母細胞瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

【關鍵詞】miR-181c-5p；N-myc下游調控基因2；人膠質母細胞瘤；增殖；侵襲；遷移

【中圖分類號】R739.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0141.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.047

人膠質母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最具有侵襲力和致命性的顱腦惡性腫瘤。世界衛生組織將GBM分為4個等級，其中Ⅳ級的GBM惡性程度最高，因其具有較高異質性和對細胞凋亡的固有抗性導致患者死亡率極高[1]。當前GBM的治療方案為手術切除、放射治療及化學治療等，但僅能提高患者約20個月的平均生存時間[2]。雖然手術可將腫瘤完全切除，但因其侵襲性較高，造成切口邊緣不能完全避免復發的可能。另外，化學放射治療對GBM細胞無特異殺傷作用，甚至還可能導致中樞神經系統發生嚴重不良反應[3]。目前，由于各種方法的療效均存在不足，導致GBM的治療仍然是一個棘手的問題。因此，進一步明確其作用機制和發現新的有效靶點仍然是一個重要課題。微小RNA可以通過與下游目標基因3'末端的非編碼區域結合，調控目標基因的表達，從而實現對腫瘤細胞生物學行為的調控。miR-181c-5p是微小RNA家族的成員，研究表明，miR-181c-5p在GBM中表達異常，通過抑制NDRG2基因表達來調控GBM的生物學活性[4]。因此，本實驗進一步研究miR-181c-5p抑制NDRG2表達調控膠質瘤細胞增殖、促進細胞侵襲、遷移等作用，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 選取2021年4月至2022年4月收治的30例非功能區膠質瘤患者術中的GBM組織標本及鄰近正常腦組織標本進行研究，應用液氮進行冷凍處理。本研究經海南省第二人民醫院醫學倫理委員會批準，取樣時均獲得患者許可同意。

1.2 材料 GBM細胞株U87；高糖液體培養基（DMEM）；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；脂質體轉染試劑2000（Invitrogen Invitrogen）；雙熒光素酶報告檢驗試劑；細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）試劑盒、NDRG2抗體、磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）抗體；Transwell孔板；多聚甲醛（POM）、NDRG2野生型（NDRG2 WT）、NDRG2突變型（NDRG2 MUT）。

1.3 細胞培養 GBM細胞系U87在10%的FBS中，37 ℃溫箱中培養，3 d進行一次換液。當細胞為長期生長狀態即可進行生物學研究。

1.4 質粒構建和轉染 將長期生長狀態的細胞接種到孔板中，采用轉染劑進行轉染，根據實驗設計分為轉染sh-NCsh-NC、sh-NDRG2、NC-mimics、miR-181c-5p mimics、NC-inhibitor、miR-181c-5p inhibitor，將其與相應的脂質體轉染試劑，分別轉染至U87細胞，轉染結束后繼續培養72 h。

1.5 實時熒光定量PCR檢測NDRG2、miR-181c-5p表達 取GBM組織及細胞U87的總RNA，將其逆轉錄為cDNA，然后根據試劑盒說明書配制PCR反應液，采用LightCycler96PCR系統進行擴增分析。PCR反應所用引物的具體序列見表1。NDRG2內參：GAPGH，miR-181c-5p內參：U6，采用2—△△Ct方法評估NDRG2、miR-181c-5p表達水平。

1.6 免疫印跡試驗（Western Blot）檢測 提取細胞總蛋白并測量其濃度，取20 μg蛋白電泳，以濕轉法轉至聚偏二氟乙烯上，封閉1 h，加相對應的一抗山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）工作液，4 ℃冰箱保存一夜。洗膜，加二抗羊抗兔IgG，1 h后曝光顯影及定影處理，進行蛋白條帶灰度值分析和蛋白表達水平計算。

1.7 細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔板中孵化48 h后加入CCK-8溶液，同時設置空白對照組。置于37 ℃下孵育1 h，測定450 nm處的吸光度值。

1.8 細胞遷移和侵襲 將U87細胞置于24孔板內培養48 h。用胰酶對U87細胞進行消化，然后用無血清培養液進行懸浮，泰盼蘭染色法將細胞濃度調到2×108/L，在 Transwell小室的上部加入100 μL的細胞懸浮液，然后在 Transwell小室的下部加入500 μL10%的血清完全培養基，在37 ℃的條件下，在遮光24 h后將其取出，用PBS沖洗干凈，棉簽將不會遷移的細胞擦拭干凈。用4%聚甲醛（POM）固定20 min，PBS沖洗3次，0.1%晶體紫法10 min，PBS沖洗，然后隨機選取5個視野，對下腔內的細胞進行計數。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 采用micro RNA在線數據庫預測NDRG2與miR-181c-5p的結合位點，擴增含結合位點的NDRG2片段，將其插入熒光素酶表達載體中，得到NDRG2野生型載體，并構建NDRG2突變型載體，將其分別與miR-181c-5p和miR-NC共轉染至內皮細胞中，然后按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.10 統計學分析 采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（x）表示，組間比較行獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBM組織標本中 NDRG2 的蛋白表達情況 GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量顯著高于正常腦組織標本，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖1。

2.2 GBM組織標本中 NDRG2 的基因水平 雙熒光素酶實驗顯示，miR-181c-5p mimics組NDRG2 WT的相對熒光素酶活性明顯低于NC mimics組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor組U87細胞中NDRG2 mRNA表達和蛋白表達高于NC inhibitor組（Plt;0.05）； miR-181c-5p mimics組U87細胞中NDRG2 mRNA 表達和蛋白表達顯著低于NC mimics組（Plt;0.05），見圖2、圖3。

2.3 轉染后U87細胞增殖、遷移和侵襲情況比較 CCK-8結果顯示，sh-NDRG2組轉染后U87細胞增殖率低于sh-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2轉染后U87細胞增殖率低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖4。Transwell 實驗顯示，sh-NDRG2組轉染后U87細胞遷移數量及侵襲數量低于sh-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2轉染后U87細胞遷移數量及侵襲數量低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組，差異有統計學意義（Plt;0.05），見圖5、圖6。

3 討論

腦膠質瘤是臨床上死亡率高、預后差且難以治愈的惡性腫瘤之一[5]。由于其具有高度的腫瘤異質性，因此，精準有效的免疫治療十分重要，而尋找合適的靶點是治療的關鍵。近年來，隨著腫瘤基礎研究的不斷深入，其分子層面上的研究也取得了長足的進步，但仍有許多癌癥基因或抑制腫瘤基因的功能尚未被挖掘，許多新的基因可能會直接影響細胞的周期進程和凋亡，從而使腫瘤細胞的成長受到抑制。因此，基因治療也與腦膠質瘤密切相關。

miRNA是一種促進或抑制癌癥的基因，參與了腫瘤的發生和發展。miRNA的功能主要是針對特定的基因發揮作用，若靶基因是腫瘤促進基因，miRNA能夠與mRNA互補結合抑制目標蛋白，從而達到對mRNA轉錄后的調節作用。相關研究顯示，miRNA能通過調控其下游目標基因的表達來調節腫瘤的生物活性[6]。miR-181c-5p是RNA-181家族中的一個重要成員，可以通過調節轉錄后目標基因的表達來抑制腫瘤細胞的生長。NDRG2是1999年我國學者通過消減雜交法發現的腦內新蛋白，主要分布在哺乳動物大腦中，屬于α/β水解酶超家族，被認為是抑制腫瘤的候選基因，與腫瘤的發生、發展相關[7]。以往研究表明，NDRG2基因在各種惡性腫瘤中均有低水平表達，并且NDRG2隨腫瘤的惡性程度和分化程度的下降而減少[8]。但也有研究顯示，在結直腸癌患者癌組織中的NDRG2基因呈高水平表達，提示NDRG2作為抑制腫瘤的候選基因，其表達與腫瘤的發生和發展具有相關性[9]。

本研究結果顯示，GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量顯著升高；雙熒光素酶實驗證實了U87細胞中miR-181c-5p可以靶向調控NDRG2的表達。另外，本研究結果也證實了U87細胞中miR-181c-5p可以靶向調控NDRG2抑制遷移和侵襲。這提示miR-181c-5p在膠質瘤進展過程中通過調控NDRG2的表達水平來抑制GMB的發生、發展[10]。

綜上所述，miR-181c-5p能夠通過調節NDRG2基因的表達，進而調節人膠質母細胞瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

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