腦出血的分子機制與治療藥物開發*

周悅,李相軍

(吉林大學藥學院實驗藥理與毒理學教研室,長春 130021)

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)指原發性非外傷性腦實質出血,其特征是腦實質出血和由于對血液成分的強烈神經炎癥反應導致的繼發性腦損傷,前者主要指血腫的占位效應及其對腦組織的壓迫,而后者主要指腦實質內的血液以及溶血產物釋放的有害物質所致腦損傷[1]。腦出血的治療手段主要包括手術治療和藥物治療。目前用于腦出血藥物治療的主要有止血類藥物、降低顱內壓的藥物、及改善腦循環的藥物,但藥物的療效并不理想,臨床上仍缺乏有效的治療藥物。隨著對腦出血發生機制認識的不斷深入,保護神經元、抑制或減少受累腦組織炎癥反應及免疫損傷、減少水腫及清除血腫成為腦出血防治藥物研發熱點。筆者對近年發現的參與腦出血進程的分子機制進行綜述,試圖為相關藥物研發提供線索,促進腦出血治療藥物研發。

1 減少神經細胞損傷

血腫對腦組織的壓迫及其所含的有害物質均可引發神經細胞損傷,使神經功能惡化。近年發現,神經細胞凋亡也是神經功能損傷的重要原因[2],通過多種途徑抑制神經細胞受損進程,減少神經細胞的死亡數量,保護神經功能,可能是腦出血治療一個方向。

1.1腦表達的X連鎖基因1(brain-expressed X-linked 1,Bex1 ) Bex1基因在中樞神經系統神經元中高度表達,常在細胞內信號通路中充當接頭或調節劑,Bex1具有抗凋亡作用。研究發現,Bex1蛋白水平在大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系PC12細胞中呈細胞周期依賴性,在G1期表達水平最低,在S期表達水平最高,證明其表達下調對于神經細胞的細胞周期退出十分必要。何明清等[3]在ICH大鼠中發現,血腫附近神經元中Bex1的表達明顯上調,活性半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(caspase-3)和Bax的表達增加,且二者均呈時間依賴性。用Bex1 siRNA抑制PC12細胞中Bex1表達,發現活性caspase-3及Bax表達明顯增加。這些證據表明,Bex1的表達可能對ICH后的神經元起抗凋亡作用,提示上調Bex1基因的表達水平的藥物在ICH后治療中可能有益。但目前以Bex1為靶點的研究僅限于基因水平,例如免疫組化、生物信息學分析等,而Bex1特異性作用物質尚不明確,有待進一步探討。

1.2黑皮質素受體4(melanocortin receptor 4,MC4R)-AMP依賴的蛋白激酶信號通路(MC4R-AMPK) MC4R是一種G蛋白偶聯受體,具有7個跨膜結構域和1個無內含子基因,具有4個潛在的糖基化位點和2個潛在的棕櫚酰化位點。MC4R 主要在中樞神經系統中表達,包括丘腦、下丘腦、皮質、海馬和腦干。

CHEN等[4]用選擇性MC4R激動劑RO27-3225激活ICH小鼠中小膠質細胞、神經元和星形膠質細胞表面的MC4R,發現其可增加血腫周圍區域AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)的表達,后者的激活可抑制促炎因子c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)的表達,減少腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-1β等促炎物質的釋放,抑制神經炎癥反應。RO27-3225還可通過激活MC4R抑制凋亡信號調節激酶1(apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)/JNK/p38 MAPK信號通路活性,減少ICH后神經元中NLRP1炎性體的激活,阻止神經元細胞的凋亡路徑,改善神經功能[5]。這些研究結果提示,MC4R可作為腦出血治療靶點,其激動劑可能對減輕ICH后神經元損傷、保護神經元功能有益。RO27-3225是目前發現的一種最有效的選擇性MC4R激動劑,受到廣泛重視,相信隨著研究不斷深入,將會為腦出血的治療帶來突破。

1.3PI3K-Akt/PTEN-Akt信號通路 Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,在促進細胞存活中起關鍵作用。Akt可激活或抑制下游信號,包括Bcl-2關聯死亡啟動子重組蛋白(Bad)、caspase-9 和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)發揮促進細胞存活和生長的作用,Akt的持續激活有利于阻止腦出血后神經細胞凋亡。目前發現,PI3K可直接激活Akt,而10號染色體上缺失的同源磷酸酶-張力蛋白(phosphatase and tensin homolog,PTEN)為PIP3磷酸酶,可將PIP3轉變為PIP2,進而抑制PI3K/Akt通路,拮抗Akt依賴性細胞存活,誘發神經細胞凋亡。研究表明,口服香葉基丙酮和腦室內注射甘氨酸對自體血注入ICH模型大鼠均有明顯的神經保護作用,其機制均與Akt激活有關,但二者激活Akt方式不同。口服香葉基丙酮通過提高PI3K表達激活Akt,而腦室內注射甘氨酸則是通過抑制PTEN的表達和活性增加Akt磷酸化水平[6-7]。可見,Akt的激活對拮抗神經元凋亡,減輕神經組織損傷,恢復其功能有重要意義,可能是治療腦出血的一個重要靶點。

目前,關于Akt的藥物研發取得較大進展,主要可分為中醫中藥開發與合成藥物開發兩大類。已被證明可以通過Akt通路治療腦出血的中藥有忍冬苷、生大黃、補陽還五湯等[8-10],同時被證明可通過Akt通路對腦出血起治療作用的化學藥物有丁苯酚[11]、依達拉奉聯合黃體酮[12]等。

1.4A20-MLKL信號通路 A20是一種去泛素化酶,被廣泛認為是一種與多種人類腦自身免疫性疾病、神經退行性疾病和腦腫瘤以及卒中有關的抗炎蛋白。研究表明,ICH后受損神經元受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1,RIP1)的表達顯著增加,并與受損神經元RIP3組成壞死性凋亡的特征復合物,激活混合譜系激酶結構域樣假激酶(mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL),導致質膜的完整性破壞,引起細胞凋亡。A20對RIP3依賴的壞死性凋亡有明顯抑制作用,激活后可明顯減少ICH后神經細胞的凋亡,改善神經元功能。陸佳楠[13]研究顯示,褪黑素治療后,C57小鼠ICH后血腫周圍小膠質細胞中A20蛋白表達被顯著上調,神經細胞凋亡明顯減少。體外應用A20 siRNA抑制A20轉錄后,褪黑素抑制神經細胞壞死性凋亡作用消失,表明褪黑素抑制ICH后的細胞凋亡,保護神經元作用是通過調節A20表達實現的[14],提示去泛素化酶A20也可能是ICH治療靶點,其激活劑可能對ICH治療有利。

目前研究發現脂聯素可以通過A20抑制脂多糖誘導的小膠質細胞炎癥反應,伊馬替尼可以通過上調A20抑制T細胞中的NF-κB通路,甲狀腺素可作用胰島β細胞上調A20 mRNA的表達,上述藥物可作用于A20,但其在腦出血治療中的探究仍需進一步探索。

1.5Miro1與GDF11 Miro1是將線粒體連接到運動蛋白的紐帶,它在神經元中輔助蛋白的作用下可以幫助線粒體沿著細胞內微管移動,其表達增加可促進體外受損神經元的線粒體運輸和分布。LI等[15]用自體血注入法復制大鼠基底神經節ICH模型時發現,ICH后大腦Miro1蛋白水平顯著增加,而敲除Miro1后,ICH后大鼠的腦損傷加重,表明ICH后腦組織損傷與線粒體轉運和分布有關。目前實驗中發現對Miro1有作用的藥物較少,僅發現匹羅卡品可誘導大鼠顳葉中Miro1表達的改變[16]。

生長分化因子11(growth and diferentiation factor 11,GDF11) 是轉化生長因子(TGF)-β超家族的成員,可以影響線粒體鈣離子(Ca2+)穩態、氧自由基(ROS)積累和線粒體去極化,減少神經炎癥反應,表明GDF11具有神經保護機制的調節潛力。XIAO等[17]發現,GDF11可通過抑制線粒體ROS產生和線粒體動態改變之間的反饋回路來保護ICH后繼發性損傷,導致線粒體功能減弱,從而減少細胞凋亡,并改善神經損傷。研究發現硫化氫可通過上調GDF11改善慢性應激大鼠海馬細胞的焦亡作用,亞精胺可以上調GDF11拮抗高糖誘導的HT22細胞內質網應激反應,提示這兩種藥物作用于GDF11,并可在腦出血領域進行新一步探索。

1.6前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2-EP2)信號通路 PGE2受體是一種G蛋白偶聯受體,作為高效的生物信使,通過誘導腺苷酸環化酶活性增加細胞內cAMP水平,進而參與蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)和環腺苷酸結合蛋白(Epac)的激活。據報道,前列腺素在中樞神經系統中經常具有相互矛盾的生理功能,PGE2-EP2-cAMP介導的PKA和Epac激活通常分別與神經保護和神經毒性作用相關。LECLERC等[18]發現,EP2受體的缺失可減少ICH后三價鐵蓄積、神經炎癥、血腦屏障的破壞和外周中性粒細胞浸潤,促進ICH后功能恢復,表明PGE2-EP2軸與調節ICH后腦損傷、炎癥和功能恢復密切相關。WU等[19]通過膠原酶誘導的ICH模型證實,PGE2受體激動劑米索前列醇可降低細胞炎癥反應,減少ICH之后的腦損傷體積、水腫和腦萎縮,減輕氧化性腦損傷。總之,PGE2在腦出血進程中作用及機制尚不清楚,PGE2受體干預劑能否成為ICH治療的有效藥物仍需進一步探究。

2 抑制炎癥反應

腦出血時的炎癥反應主要由腦實質內的血液觸發,小膠質細胞和星形膠質細胞是第一反應者。腦出血后,有害成分作用于炎癥反應通路,引發神經炎癥,加重腦水腫,使神經功能惡化,病死率增加。故抑制炎癥反應通路,在ICH治療中具有重要意義。

2.1核因子E2相關因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(anti-oxidant response element,ARE)信號通路 Nrf2是一種主要的Ⅱ相基因調節因子,是一種廣泛表達的轉錄因子,可與ARE共存并調節Ⅱ相解毒酶的表達。研究表明[20],Nrf2-ARE信號通路激活可促進其下游血紅素加氧酶(HO-1)的表達,后者可抑制NF-κB及下游炎癥因子的表達,抑制ICH后炎癥反應的發生。WEI等[21]通過實驗證明,煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide,NMN)可激活Nrf2/HO-1信號通路,抑制ICH小鼠神經炎癥以及氧化應激、神經細胞凋亡。INIAGHE等[22]發現食品防霉劑富二甲酯在小鼠ICH后可激活酪蛋白激酶2和Nrf2信號通路,進而發揮改善炎癥、降低血腦屏障通透性并改善神經系統等功能。SHI等[23]發現富馬酸單甲酯作為一種工業中間體,可激活microRNA-139/Nrf2軸,發揮抑制氧化應激和炎癥反應的功能。這些研究成果顯示,Nrf2-ARE-HO-1通路的激活劑可能在ICH治療中有積極意義。NMN、富二甲酯以及富馬酸單甲酯具有發展成為腦出血治療藥物的潛能。

2.2Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)4-NF-κB相關通路 TLR是一個病原體識別受體家族,可識別保守的微生物序列,其中TLR4是受體家族的重要成員,功能與炎癥反應密切相關。腦出血后紅細胞溶解,釋放游離血紅素。血腫成分即血紅素可激活小膠質細胞上表達的TLR4,并通過TLR4下游MyD88/TRIF信號通路實現轉錄因子NF-κB的激活,調節炎癥遞質基因表達,最終導致腦出血炎癥損傷加重。LAI等[24]發現,苯乙醇苷類抗氧化劑毛蕊花苷作為多種藥用植物的活性成分,可阻斷激活的小膠質細胞TLR4促炎通路,降低促炎因子如 NF-κB、IL-1β的水平。茶黃素具有多種生物學功能,如抗誘變性、自由基清除、抗癌、抗病毒、降血脂以及抗炎活性。FU等[25]用Ⅶ型膠原酶誘導ICH大鼠模型,通過管飼法進行不同劑量茶黃素預處理,結果分析發現,NF-κB-p65、IL-1β和caspase-1的mRNA水平在ICH發作后明顯上調,但在茶黃素預處理后下調。表明茶黃素作為一種抗炎因子,可通過抑制NF-κB相關通路抑制氧化應激和炎癥反應,減輕ICH引起的大鼠炎癥反應和腦損傷。

綜上所述,抑制TLR4-NF-κB相關通路可抑制氧化應激和炎癥反應,減輕ICH引起的大鼠炎癥反應和腦損傷。毛蕊花苷與茶黃素均可作用于TLR4-NF-κB相關通路,發揮治療腦出血的作用,具有開發為腦出血治療藥物的可能性。

2.3核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)-IL-1β/IL-18信號通路 NLRP3炎性體是一種IL-1β家族細胞因子激活蛋白復合物,其激活與各種神經病理學中的炎癥反應有關。一旦被激活,NLRP3會調節caspase-1介導的IL-1β和IL-18的成熟,從而導致炎癥細胞的后續聚集。因此,使用針對NLRP3的治療劑進行干預可能會減少ICH損傷的嚴重程度。

研究表明,水飛薊素可通過下調NLRP3、caspase-1和IL-1β表達來防止炎癥反應[26]。小劑量非馬沙坦作為選擇性AT1受體阻滯劑低劑量預處理可通過降低NLRP3/ASC/caspase-1和NF-κB通路的激活保護急性ICH的繼發性損傷[27]。第一個從真菌中分離出來的核苷類抗生素——蟲草素也可通過下調NLRP3炎性體成分的表達以及減少炎性體底物IL-1β和 IL-18的產生和釋放發揮抗炎作用[28]。提示NLRP3抑制劑在治療ICH方面可能具有廣闊前景。水飛薊素、小劑量非馬沙坦、蟲草素抑制NLRP3相關通路,發揮治療腦出血的作用,可以為腦出血治療藥物的開發提供參照。

2.4IL-17A與IL-33 小膠質細胞激活是ICH中神經炎癥的重要因素。YU等[29]研究發現,IL-17A可加重ICH 誘導的小膠質細胞活化和神經炎癥,而IL-17A Abs 可以降低ICH誘導的TNF-α、IL-1β和IL-6蛋白水平,并且其下游的信號因子MyD88、TRIF、IκBα和NF-κBp65的水平被顯著抑制,表明IL-17A Abs可以抑制ICH誘導的神經炎癥,為治療ICH提供新的可能。

IL-33是最近發現的IL-1家族成員,它通過與IL-1受體相關蛋白ST2 和IL-1RAcP 組成的異二聚體結合發揮生物學功能。IL-33誘導的信號轉導的結果是將IRAK、IRAK4、MyD88和TRAF6募集到ST2,最終導致 NF-κB激活。GAO等[30]研究發現,IL-33腦室內注射可減輕腦含水量,減少凋亡細胞的數量,改善ICH后的神經功能,其機制可與IL-33抑制促炎細胞因子IL-1β和TNF-α的表達有關。

2.5Nurr1(NR4A2) Nurr1是主要在中樞神經系統中表達的核受體家族的成員,這種核受體可以作為大腦炎癥反應的調節劑。阿莫地喹是一種4-氨基喹啉類抗瘧疾藥物,被證明對 Nurr1 具有激動活性。研究發現[31],向膠原酶誘導ICH小鼠的腹腔中注射Nurr1激動劑阿莫地喹,可以顯著抑制血腫周圍區域活化小膠質細胞的積累。同時,阿莫地喹也顯著抑制IL-1β、趨化因子CXCL2和CCL2mRNA的表達水平,減輕與神經膠質細胞活化相關的炎癥反應,而且還能改善 ICH 后的神經系統預后。在此基礎上,研究發現龜羚帕安丸可以上調帕金森病大鼠中腦黑質Nurr1的表達[32],海洛因可以上調大鼠中腦腹側被蓋區中Nurr1蛋白表達[33]。這兩種藥物作用機制的發現為腦出血疾病的治療提供新的線索。

3 減少免疫損傷

ICH引起強烈的骨髓(單核細胞和中性粒細胞浸潤以及小膠質細胞)和淋巴(T細胞)免疫反應,從外周免疫系統侵入血管神經單元的炎癥細胞是繼發性損傷的一個主要驅動因素。研究表明,免疫反應存在于腦出血后繼發性腦損傷的各種病理生理過程,二者具有密切的聯系,如神經炎癥、腦水腫以及神經元損傷中均貫穿著免疫反應,免疫損傷與腦出血后的損傷密切相關[34]。

T淋巴細胞是特異性免疫系統中的關鍵細胞,在細胞介導的免疫反應中起關鍵作用。T 細胞活化過程需要由B7-1(CD80)/B7-2 (CD86) 結合同源受體 CD28/CTLA-4 來提供二級信號傳導,進一步傳遞陽性信號。研究發現,ICH小鼠內眥注射抗B7-1抗體后,T細胞和B細胞的增殖率均降低,促炎細胞因子IFN-γ和抗炎細胞因子IL-4比例失衡被逆轉,而ICH小鼠學習記憶能力明顯提升,表明阻斷B7-1/CD28信號通路有助于促進空間記憶恢復,改善ICH 結局[35]。目前有研究發現,蒙藥森登-4可通過下調CTLA-4/B7-1的表達降低CIA大鼠炎性反應[36],參地顆粒聯合黃葵膠囊治療可降低慢性腎小球腎炎患者體內B7-1水平[37],因此可以進行這兩種藥物在腦出血模型中的研究,促進腦出血治療藥物開發。

4 減輕水腫與清除血腫

顱內壓力升高使腦組織缺血、缺氧,造成神經細胞功能不可逆的損傷,進而造成腦出血的二次傷害。顱內壓的變化是導致腦出血不良后果的重要原因之一,影響顱內壓變化的主要因素是血腫周圍的水腫和產生的血腫量。水腫的產生原因很多,如血管源性因素、凝血級聯反應及凝血酶生成、炎癥反應、紅細胞溶解和補體攻擊等。其中最常見的是血管源性水腫,由腦出血后靜脈壓力升高引起,促進緊密連接蛋白的分解從而破壞血腦屏障,導致滲出液及細胞外液進入腦實質,造成腦水腫。研究表明,許多因子能夠改善血腦屏障通透性,且血塊的形成對血腫周圍腦水腫的產生及進展具有重要作用。

4.1大麻素受體2(Cannabinoid receptor 2,CB2R)-MKP-1信號通路 研究發現,CB2R激動劑JWH-133可顯著下調TGF-β1水平,減少側腦室容積,改善相關的神經功能缺損,抑制神經炎癥和減少血腦屏障損傷,其機制可能與CB2R激活后上調絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen-activated protein kinase phosphatase1,MKP-1)信號通路,進而抑制ICH誘導的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)過度激活有關[38-39]。目前有研究證明可以激動CB2R的藥物有芍藥苷、石甘散聯合托吡酯等。隨著化學合成的發展,有實驗研究發現噠嗪-3-甲酰胺類化合物對CB2R有選擇性激動作用,這為CB2R激動劑的合成帶來新的突破,也極大促進腦出血藥物開發利用。

4.2過氧化物酶體增殖物激活受體-γ(peroxisome proliferators-activated receptorsγ,PPAR-γ)-Hp-Hb-CD163信號通路 PPAR-γ 是一種轉錄因子,可以調節過氧化氫酶和超氧化物歧化酶這兩種重要的抗氧化基因的表達,與促進血腫清除和減少腦出血后的神經功能障礙有關。WANG等[40]發現,PPAR-γ激動劑紅霉素可顯著上調ICH小鼠PPAR-γ、觸珠蛋白(Hp)和 CD163 的表達水平,其機制與PPAR-γ激活Hp-Hb-CD163途徑,進而保護 Hb 免受氧化修飾,形成Hp-Hb-CD163復合體系,介導血紅蛋白的內吞作用,促進Hb清除有關。辛伐他汀也可激活PPAR-γ、上調CD36而增強血腫清除和減輕神經功能缺損[41-42]。上述結論表明,PPAR-γ激動劑紅霉素、辛伐他汀作為腦出血治療藥物具有進一步開發的潛能。

5 總結與展望

腦出血機制復雜,癥狀重,愈后差,致殘率和致死率均較高。外科手術的發展為腦出血患者帶來福音,但繼發性腦損傷卻仍可通過多種機制發生,導致患者預后仍不理想,因而需要外科治療與藥物治療相互補充,共同改善腦出血的治療效果。藥物治療主要目的是減少神經細胞損傷,抑制炎癥反應,減少免疫損傷及抑制腦水腫和血腫,因而筆者針對這4個方面的機制進行闡述。筆者在本文對參與腦出血發生發展的主要因子及信號通路進行綜述,可為治療腦出血藥物研發提供線索。