基于SSR標記的廣西壯族自治區柑橘主栽品種遺傳多樣性分析

摘 要：為探明廣西壯族自治區柑橘主栽品種的遺傳多樣性，利用21對簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記引物對7個柑橘品種的基因組脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）進行分析，研究各種間的遺傳親緣關系及遺傳距離。試驗結果表明：利用21對SSR引物對7個柑橘品種的基因組DNA進行擴增，共獲得172條譜帶，平均每個引物擴增出8.19條譜帶，其中多態性條帶數量為136，多態性比率為79.07%；7個柑橘品種間的遺傳相似系數為0.000～0.786，平均值為0.529；根據聚類分析結果，7個柑橘品種在遺傳相似系數為0.513處可以分成四大類群。這說明7個柑橘品種具有豐富的遺傳多樣性，SSR分子標記技術可以較好地揭示柑橘品種之間的遺傳差異和親緣關系。

關鍵詞：柑橘；SSR標記；遺傳多樣性

中圖分類號：S566.1 文獻標志碼：B 文章編號：1674-7909（2023）12-93-4

0 引言

柑橘是我國廣泛種植的一種常見水果，近年來柑橘產業飛速發展，人們對其的需求量與日俱增。廣西壯族自治區（以下簡稱廣西）自然條件優越，十分適宜柑橘生長，是我國柑橘的主要產區之一。通過多年的引種育種，廣西柑橘品種繁多，遺傳多樣性豐富，但這導致品種區分難，進化起源問題極其復雜。在此背景下，研究柑橘品種的遺傳多樣性對柑橘品種區分及種質資源的搜集保存、鑒定評價具有重要意義。

脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid，DNA）分子標記技術廣泛應用于植物遺傳多樣性和種質鑒定研究，常用的DNA分子標記有簡單重復序列（Simple Sequence Repeats，SSR）標記、隨機擴增多態性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）標記、單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記等。其中，SSR分子標記技術具有穩定性高、操作簡單、方便快捷等特點，被廣泛應用于植物遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、輔助育種、遺傳圖譜構建等領域［1-3］。例如，劉通等［4］利用SSR分子標記技術對廣西野生柑橘品種、地方品種及對照品種進行了遺傳多樣性研究，利用22對SSR引物對34份不同的材料進行了分析，產生了221條多態性條帶。吳娟莉等［5］利用23對SSR引物對38份金柑及其近緣屬種質進行分析，擴增得到265條有效性條帶、250條多態性條帶，多態性比率為92.99%。馬麗麗等［6］利用11對SSR多態性引物對17份早花檸檬材料進行分析，共檢測出92個等位變異，平均每對引物檢測出8.5個等位變異，同時在遺傳相關系數為0.65處將17份材料分為4個類群。相關研究表明，SSR分子標記技術是研究植物遺傳多樣性的有效方法之一［7-11］。基于此，筆者利用21對具有較好多態性的SSR引物對廣西7個柑橘主栽品種的遺傳多樣性進行研究，探討各品種間的遺傳親緣關系及遺傳距離，以期為柑橘的遺傳育種研究提供更多理論依據。

1 試驗材料與方法

1.1 供試品種

試驗共采用7個柑橘栽培品種，分別為貢柑、沃柑、金橘、砂糖橘、夏橙、沙田柚、茂谷柑。

1.2 SSR引物

試驗共選用21對SSR引物，引物序列由《柑橘屬品種鑒定 SSR分子標記法》（NY/T 3436—2019）提供，由金斯瑞生物科技股份有限公司合成（見表1）。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA提取。筆者于2022年10月從廣西壯族自治區農業科學院的柑橘種植基地進行取樣，分別從7個柑橘品種植株上各取3片葉，分別提取各品種葉片DNA：將葉片去除中脈后用剪刀剪取中間部分，剪碎后混勻放入研缽中，加入適量液氮直至研磨成粉末狀，取100 mg置于1.5 mL離心管中，加入1%改良十六烷基三甲基溴化銨（Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide，CTAB）緩沖液750 μL，渦旋振蕩混勻后于65 ℃水浴45～60 min，加入三氯甲烷500 μL，顛倒混勻，12 000 r/min離心5 min，轉移上清液約0.5 mL至新離心管中，加入等體積（0.5 mL）預冷至4 ℃的無水乙醇，顛倒混勻，-18 ℃冰箱下靜置1 h，12 000 r/min離心3 min，去上清液，于室溫下干燥沉淀，最后加入Tris-EDTA（TE）緩沖液50 μL，于18 ℃冰箱中保存備用。

1.3.2 聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）。PCR反應體系見表2。

PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，60 ℃（具體退火溫度由不同的引物決定）退火40 s，72 ℃延伸45 s（根據擴增片段的長度做出適當調整），共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.3 電泳檢測。用8%聚丙烯酰胺混合液制作凝膠，將凝膠固定于電泳槽中，對PCR產物進行電泳檢測，最后用掃描儀掃描膠片，保存結果。

1.4 數據處理

在數據統計與分析中，每對SSR引物檢測1個位點，視每條多態性帶為1個等位基因；將觀測到的每條帶視為1個性狀，有此帶時賦值為“1”，無此帶時賦值為“0”，所有數據處理使用NTSYSpc2.02軟件完成。

2 試驗結果與分析

2.1 7個柑橘栽培品種基因組DNA的遺傳多樣性

由表3可知，21對SSR引物共擴增出172條譜帶，其中多態性條帶數量為136，多態性比率為79.07%，擴增出的條帶相對分子量均小于500 bp，平均每對引物擴增出8.19條譜帶，平均每對引物擴增出的多態性條帶數量為6.48。這表明7個柑橘栽培品種間具有豐富的遺傳多樣性，SSR分子標記技術可以有效揭示供試柑橘品種間的遺傳差異和親緣關系。

2.2 7個柑橘栽培品種基因組DNA的遺傳相似性

由表4可知，7個柑橘栽培品種間的遺傳相似系數為0.000～0.786，平均值為0.529。其中，金橘與夏橙的遺傳相似系數最大（0.786），表明金橘與夏橙的遺傳距離相對較近；貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳相似系數最小（均為0），表明貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳距離相對較遠。

2.3 7個柑橘栽培品種聚類分析

由圖1可知，在遺傳相似系數為0.513處，可以把7個柑橘栽培品種分成四大類群。第一類群僅有貢柑，第二類群包括沃柑、沙田柚、金橘、夏橙，第三類群僅有砂糖橘，第四類群僅有茂谷柑。在遺傳相似系數為0.571時，第二類群又能分成2個亞群，第一亞群包括沃柑、沙田柚，第二亞群包括金橘、夏橙。第二類群的各柑橘品種間遺傳相似系數相對較大，表明沃柑、沙田柚、金橘、夏橙的遺傳距離較近；其中金橘與夏橙的遺傳相似系數最大，表明金橘與夏橙的遺傳背景最相似，兩者的親緣關系最近。

3 結論與討論

近年來，柑橘作為區域特色經濟林木在廣西廣泛推廣種植，已成為廣西鄉村振興、農民增收致富的重要產業。目前，廣西栽培的柑橘品種以砂糖橘為主，其他品種有沃柑、臍橙、茂谷柑、貢柑、金橘等。利用SSR分子標記技術對廣西柑橘主栽品種的遺傳多樣性進行分析，可為柑橘的遺傳育種提供參考。

此次試驗結果表明，21對SSR引物共擴增出172條譜帶，其中多態性條帶數量為136，多態性條帶比例為79.07%，表明7個柑橘品種間具有豐富的遺傳多樣性；7個柑橘品種間的遺傳相似系數為0.000～0.786，平均值為0.529。其中，金橘與夏橙的遺傳相似系數最大（0.786），表明金橘與夏橙的遺傳背景最為相似，親緣關系最近；貢柑與砂糖橘、貢柑與茂谷柑的遺傳相似系數相對較低，親緣關系較遠。

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