豬捷申病毒形態(tài)特征及實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究

近年來，豬捷申病毒（PRV）是豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRV）和偽狂犬病毒（PEV）基因融合后產(chǎn)生的一種病毒。PRV感染仔豬能引起呼吸困難和死亡。豬捷申病毒能夠引起偽狂犬病毒感染及偽狂犬病導(dǎo)致斷奶仔豬死亡，在我國多個地區(qū)均有報(bào)道死亡豬或偽狂犬病毒病流行。基于此，本文簡單介紹PRV形態(tài)特征和其流行規(guī)律，并且深入研究PRV實(shí)驗(yàn)室診斷方法，以供參考。

一、PRV形態(tài)特征

1、序列同源性

豬捷申病毒基因組中的p53蛋白在進(jìn)行蛋白質(zhì)純化時并不與p53片段結(jié)合，而是形成與p53完整序列相一致的多股螺旋體，因此不能直接檢測到。PRV RNA中部分序列與PRV基因組中部分RNA序列相匹配。PRV核酸由核糖核苷酸鏈連接酶Seak催化產(chǎn)生，由核酸酶（Receptor）催化并結(jié)合在堿基序列（ORP）上復(fù)制。PRV病毒基因組蛋白Receptor中含有一個核苷酸不對稱復(fù)體，這種特征與豬捷申病毒Receptor蛋白具有相同序列，也稱為反向遺傳因子RSV/p53同源性系數(shù)為0.467。PRV基因組中rSV蛋白基因型與EH2蛋白基因型同源性系數(shù)為0.454。

2、親緣關(guān)系

豬捷申病毒的宿主動物為各種家畜，包括豬、牛、羊、駱駝、綿羊、山羊、馬、兔、雞、鴨、鵝、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（AVTV）、豬流感病毒（AVTV）等。PRV病毒與豬白痢病毒、藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒等其他毒株不存在親緣關(guān)系。EH2病毒屬單股單毒，與其他毒株無親緣關(guān)系。PRV與豬偽狂犬病病毒、偽狂犬病病毒有親緣關(guān)系，與豬流行性感冒病毒屬單股單毒。與流行性腦炎病毒屬單股單毒，與流行性腮腺炎病毒屬單股單毒，與流行性腦炎病毒屬單針單毒，與流行性腮腺炎病毒屬單針單毒，與流行性感冒病毒屬單股單毒，在豬中存在5種不同毒力和致病力種類的血清型PRV。由于血清型間無特異性抗原結(jié)合位點(diǎn)，目前僅能分離出血清型抗原呈遞和病毒與免疫血清進(jìn)行交叉免疫反應(yīng)測定。

3、免疫親和力及對豬的適應(yīng)性

PRV是天然存在的抗病毒病原體，PRV在自然界中廣泛存在，并且與多種動物都有較強(qiáng)的親和力。不同品種對PRV有不同免疫力。經(jīng)全血培養(yǎng)可獲得不帶毒血清，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳或離心后，可觀察到一定量呈凝膠狀的微量抗體存在，其中1ml病毒可在20℃下熱致死。抗PRV抗體陽性豬無病或少病，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳觀察時可發(fā)現(xiàn)多克隆抗體呈陽性（3個克隆），經(jīng)IgG凝膠電泳觀察時可發(fā)現(xiàn)存在兩個克隆。

4、病毒生物學(xué)特性

在體外，PRV病毒在pH6.0～6.8和pH6.6～6.8之間的pH下穩(wěn)定，pH范圍為5.5～6.5，一般不會感染其他病毒或抗體（RPIV除外）。在37℃、pH5.0以上條件下，病毒才能正常生長繁殖。在50℃孵育2d即可滅活，在25℃孵育1d可殺死病毒。經(jīng)NAA等保護(hù)性處理后，PRV可被宿主免疫細(xì)胞（VSV+MCV）吞噬作用殺死大部分。PRV也可被NAA、IFN-γ等細(xì)胞免疫作用殺死。PRV不能感染動物（PRV除外）或活動物，因此不要與豬接觸，防止傳播。PRV在接觸后會迅速失活，與健康豬接觸時可以通過鼻咽部位黏膜或皮膚感染。PRV也可以通過呼吸道飛沫傳播，PRV病毒對冷凍干燥不敏感（低于0℃或相對濕度低于60%），PRV病毒對紫外線處理均無抵抗力。

5、分子分型與抗原設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)中采用RNA疫苗（簡稱RRV）誘導(dǎo)多窩小鼠進(jìn)行體內(nèi)感染，小鼠于第1窩接受本病毒感染，隨后分別在第2和第3窩注射含有本病毒抗原（BV或PRV病毒）的血清，每窩3頭。小鼠感染后72h內(nèi)均出現(xiàn)臨床癥狀，5周后再注射含有本病毒抗原（BV或PRV）的血清。PRV病毒抗原有幾種主要類型：第一，針對豬呼吸道、消化道、淋巴結(jié)或血液等體液中存在的感染病原時設(shè)計(jì)；第二，針對病毒存在于動物組織中存在于血液中或淋巴液中存在于體液中傳播時設(shè)計(jì)；第三，抗原針對特定部位（如耳根、眼窩）存在于體液中；第四，僅針對單克隆抗原設(shè)計(jì)；第五，針對不同部位抗原表達(dá)形式設(shè)計(jì)。此外還可以根據(jù)豬免疫抗體或PRV病毒DNA序列設(shè)計(jì)抗原進(jìn)行免疫效果評估，結(jié)果顯示豬捷申病毒抗原誘導(dǎo)多窩小鼠產(chǎn)生高滴度抗體，對接種PRV血清后2周內(nèi)產(chǎn)生抗小鼠抗體效果最佳。

6、致病性

PF病毒無特異性免疫，感染健康豬后不會產(chǎn)生特異性抗體，也不產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，只具有抗原性。感染PF的仔豬，可表現(xiàn)出體溫升高、呼吸困難、生長遲緩、皮膚出現(xiàn)紫斑、黏膜發(fā)紺等癥狀，如不及時治療病死率可達(dá)90%。母豬受驚或感染PF后，常出現(xiàn)流產(chǎn)或早產(chǎn)現(xiàn)象，常因母豬產(chǎn)下感染的仔豬不健康，而導(dǎo)致死亡。仔豬發(fā)育不良、體溫升高的同時伴隨呼吸困難和紫斑等癥狀，也是引起本病的主要原因。健康仔豬的初生重較高或死亡率可達(dá)90%以上，而死亡率較低的豬只大多在7日齡以后出現(xiàn)紫斑和死亡。母豬亦可能感染PF而出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)現(xiàn)象（少數(shù)母豬可以引起早產(chǎn)）。

二、PRV流行規(guī)律

1、感染時期

流行病學(xué)PRV感染的豬群通常在育肥后期、哺乳仔豬斷奶后開始感染，妊娠母豬感染率較高，多發(fā)生于母豬產(chǎn)房，產(chǎn)后1～4周內(nèi)感染最多。病死率可達(dá)5%～15%，且病豬具有一定傳染性。從豬場內(nèi)外分離到的PRV陽性豬，并不一定與病豬直接接觸，也有可能是被感染母雞所產(chǎn)蛋禽通過胎盤傳染給豬。PRV感染性豬群在其感染前后均有較高的發(fā)病率，豬場內(nèi)部感染豬群平均發(fā)病率為6%～14%.經(jīng)調(diào)查，受哺乳仔豬感染豬的發(fā)病率約為8%～10%，PRV感染可能發(fā)生于產(chǎn)前母豬（產(chǎn)房中感染率較高）。

2、傳播途徑

PRV主要通過接觸傳播，尤其是直接接觸病豬和染病的育肥豬與病死豬。在豬群中，豬只和病死豬可能成為傳播PRV病毒的媒介。PRV通過病死豬、被污染的飼料、水以及飼料加工工具進(jìn)行傳播，這些工具通常包括各種運(yùn)輸工具及用具（如運(yùn)輸帶毒動物），特別是運(yùn)輸帶毒車輛。在正常情況下，病死豬和病死仔豬只會污染環(huán)境。健康豬在感染或發(fā)病后的尸體或病死豬污染的環(huán)境中，經(jīng)消化道感染也可引起PRV感染。有研究發(fā)現(xiàn)，PRV可通過接種病毒性傳染病疫苗而致病。同時由于PRV感染可造成免疫抑制，從而導(dǎo)致發(fā)病后豬場內(nèi)發(fā)生新類型傳染病的風(fēng)險增大。

3、感染途徑

PRV主要在空氣中存活，污染飼料、飲水及用具等，易被受感染的豬和健康無癥狀豬攜帶和感染。通常豬被感染后2～3天出現(xiàn)臨床癥狀，2～3周內(nèi)死亡。健康豬接觸攜帶PRV的豬或健康無癥狀豬時感染率為30%左右。在正常情況下，PRV主要在3～5天內(nèi)自宿主組織內(nèi)排出，不經(jīng)消化道或呼吸道排出的病毒稱為毒力弱陽性病毒。可通過直接接觸、呼吸道飛沫及糞便排出污染土壤、水和空氣，或接觸受感染動物或其他病原污染的物品而感染，PRV主要通過消化道傳播、呼吸道感染和接觸傳播。

4、感染時間

PRV感染后潛伏期約為3～7d，發(fā)病2～3d后潛伏期延長為6～8d，可長達(dá)2～3個月。感染后無明顯的臨床癥狀，只在采食或飲水時出現(xiàn)急性呼吸道癥狀，隨即發(fā)病，病程可長達(dá)2～3d。發(fā)病3d后，病豬會因采食和飲水等因素導(dǎo)致呼吸困難而死亡。潛伏期長短與發(fā)病豬數(shù)量呈正相關(guān)，通常小于2d但大于4d。

5、傳染源

PRV可通過受感染野豬和健康的畜禽（例如豬）之間的飛沫或唾液傳播，病原借此在人、豬、犬和鳥類之間進(jìn)行傳播。豬是PRV的主要傳染源，而家豬是PRV傳染的重要傳染源。因此，一旦發(fā)現(xiàn)豬與家豬之間有呼吸道接觸，立即用清水洗凈衣物、用具進(jìn)行消毒，將傳染源隔離開，同時禁止家豬與野豬接觸家豬時使用被污染的器具或飼喂過含病原的飼料及飲水。飼養(yǎng)人員和生豬及其產(chǎn)品應(yīng)注意清潔和消毒衛(wèi)生，嚴(yán)防受感染家豬出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)等情況。

三、實(shí)驗(yàn)室診斷方法

1、檢測方法

采用病毒DNA檢測PF毒株DNA序列的方法，對PF毒株的病毒DNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，通過PCR測定毒株的核酸。PCR檢測方法采用一步法，測定PFVDNA核酸。在病毒基因組中含有3個基因，分別為G（TPD）、G（TD-I）和G（A2DE），其中GG與GA2DE的位點(diǎn)重合即可確診此病。TPD與A2DE檢測方法對3個基因型的PFV標(biāo)本進(jìn)行PCR檢測，PCR產(chǎn)物用ELISA細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋100倍得到10μLTB-3或2μLA2DE樣品進(jìn)行檢測研究。檢測采用熒光PCR法和瓊脂糖凝膠電泳加特異引物檢測。由于目前本病毒多為非整倍體，因此在檢測時只需將本病毒RNA提取、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和TMIC等擴(kuò)增產(chǎn)物分別與已知的PFV核酸樣品進(jìn)行比較便可得到檢測結(jié)果。熒光PCR法擴(kuò)增鑒定方法，需要選擇最具代表性的5個PCR擴(kuò)增品系進(jìn)行測定鑒定該病毒是否存在于TLR2細(xì)胞或其他細(xì)胞中尚未發(fā)現(xiàn)該病毒核酸。此方法不能用于分離任何其他生物樣本檢測；若使用該方法仍然存在一定誤差時則可根據(jù)所含基因特征來進(jìn)一步判斷其是否已感染TMT細(xì)胞或其他部位的組織中尚未發(fā)現(xiàn)該病毒核酸。

2、注意事項(xiàng)

由于本病具有較強(qiáng)的感染性，因而必須加強(qiáng)生物安全防護(hù)，在處理過程中必須戴好手套和口罩，并保持環(huán)境清潔衛(wèi)生。在進(jìn)行采樣時應(yīng)選擇晴天進(jìn)行采樣，以防止太陽暴曬；采樣過程中避免使用具有腐蝕性的消毒劑。本方法對于細(xì)菌和病毒的檢出限可達(dá)到50～100ng/ml，并能與其他檢測方法相結(jié)合。此方法能夠迅速而準(zhǔn)確地檢測到豬PF病毒感染情況，但同時也存在一些不足之處。首先，缺乏有效的檢測方法。本病缺乏高效、便捷、經(jīng)濟(jì)的檢測方法，并且目前使用該方法仍以熒光PCR法為主，而該方法對抗原和產(chǎn)物檢測值的要求很高。其次，抗原反應(yīng)需達(dá)到一定濃度才能被檢測到。鑒于此種方法較快及便捷原則，因此可能出現(xiàn)抗原在濃度很低時檢測不到而在濃度很高時又被檢測到了現(xiàn)象。最后，不同區(qū)域可能出現(xiàn)不同類型反應(yīng)。目前世界范圍內(nèi)尚無針對PF毒株的疫苗問世，這對于防控PF十分重要。因此，在疾病易發(fā)區(qū)域應(yīng)對豬重點(diǎn)實(shí)施疫苗免疫治療并加強(qiáng)豬場管理，并在飼養(yǎng)過程中定期使用抗病毒藥進(jìn)行預(yù)防。

3、抗原分析

使用豬病原檢測試劑盒對PF病毒進(jìn)行抗原分析，抗體陽性率在80%以上，陽性率在40%～60%，陰性率在5%～10%。抗原分析是以TD-I為抗原的一種新型檢測手段，通過PCR方法獲得該抗原后，與其他病毒或細(xì)菌等特異性抗原進(jìn)行免疫檢測。檢測產(chǎn)品選擇金杜霉素，通過抗原比對陽性結(jié)果，抗原識別位點(diǎn)（CU）：TD-I為6～11個重復(fù)的核苷酸（BAE）區(qū)。

4、陽性對照

采用pyRNA-ELISA試劑盒對PF基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，當(dāng)反應(yīng)物與PCR產(chǎn)物之間出現(xiàn)兩條重疊序列時即為陽性，且需要在PCR產(chǎn)物中再次找到相應(yīng)的交叉引物作為特異性引物。一般陰性對照應(yīng)至少有一個病毒序列，陽性對照之間至少應(yīng)該有一個交叉引物，如果陽性對照組中沒有病毒，則表明該病毒沒有在該樣本中檢測到。結(jié)果在RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA序列的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)了新的RT-PCR基因序列，該基因與pyPF/pyELISA結(jié)合，具有獨(dú)特的抗原呈遞機(jī)制和特異性抗體構(gòu)建方法。使用熒光PCR法可進(jìn)一步觀察到陽性對照中是否存在兩條重復(fù)序列。

5、實(shí)驗(yàn)室條件

實(shí)驗(yàn)室需具備以下條件：第一，具有充足的菌種儲備：如乳酸桿菌、梭狀芽孢桿菌、葡萄球菌、炭疽桿菌、化膿性鏈球菌等。第二，具有穩(wěn)定的環(huán)境條件：如實(shí)驗(yàn)室溫度為5～8℃，相對濕度小于等于85%，相對濕度控制在50%～80%。第三，具有一定的實(shí)驗(yàn)操作條件：如實(shí)驗(yàn)室無人員，不能接觸病原；實(shí)驗(yàn)室可以采用自動控制（全自動）設(shè)備實(shí)施工作；實(shí)驗(yàn)室設(shè)施齊全；儀器設(shè)備性能穩(wěn)定，維護(hù)簡單。第四，具備必要的檢測條件。可配置相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室儀器、試劑盒，如酶聯(lián)免疫吸附測定儀、酶提取試劑盒等。第五，具備相應(yīng)的檢測條件，如設(shè)備齊全、儀器穩(wěn)定、功能齊全、維護(hù)方便，實(shí)驗(yàn)室需配備相應(yīng)的藥品和試劑盒或儀器用品。

6、培養(yǎng)基配制

將病料置于50ml無菌生理鹽水中，放入10ml/瓶的青霉素，充分?jǐn)嚢韬蠹尤?ml/瓶。使用時將瓶蓋蓋上，搖勻，使各藥液均勻混合成混合物。培養(yǎng)基配制成功后，再按A、B組2種血清培養(yǎng)基的藥敏濃度加藥敏培養(yǎng)基配制1個藥敏試劑瓶。使用前需將藥敏試劑瓶消毒，并將瓶蓋擰緊。將藥敏試劑瓶放置于無菌溫度下保持5～10min，然后將5℃保存并用完。使用前需將所有未加藥敏試劑瓶用10ml無菌生理鹽水稀釋后置于37℃冰箱內(nèi)保存，待5min內(nèi)無菌生理鹽水達(dá)到室溫后可用來進(jìn)行檢測使用。使用時將培養(yǎng)基加入到50ml無菌生理鹽水中，再將上述混合物均勻攪拌幾次后放置10min即可產(chǎn)生檢測用的結(jié)果。

7、實(shí)驗(yàn)操作

將樣品A、B各接種1mL，置于200℃，60min無菌條件下燒瓶，待反應(yīng)液完全溶解后，取出樣品，加入10mL滅菌培養(yǎng)基。待細(xì)菌生長至一定程度后，于500℃滅活12min，加入200ul培養(yǎng)基，每4min測一次生長曲線，檢測結(jié)果以柱層析法來判斷。將培養(yǎng)基置于0.1%瓊脂平板上，然后在滅菌槽上加50ul溶液20μL消毒。用1μLELISA瓊脂平板分別置于5%鹽酸/10%硝酸或75%乙醇溶液中20min，然后轉(zhuǎn)移到40℃冰箱中待用。將樣品A、B分別于4、10、20min無菌條件下燒瓶冷卻至室溫。在100～120min無菌條件下滴加250ul稀釋液即可得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后再按5倍稀釋倍數(shù)加入5μL滅活反應(yīng)液進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，5mL滅活反應(yīng)液能夠檢測出5倍稀釋倍數(shù)時抗體陽性率，在50～120min無菌條件下滴加250ul稀釋倍數(shù)時抗體陽性率，而50～120min無菌條件下滴加250ul稀釋倍數(shù)時抗體陰性率。所以，可以將5倍稀釋倍數(shù)作為實(shí)驗(yàn)室診斷的標(biāo)準(zhǔn)參考值，這需要得到重點(diǎn)關(guān)注。

8、病毒檢測

熒光PCR檢測是目前檢測PRV的主要方法，但其缺點(diǎn)是需要花費(fèi)大量時間進(jìn)行測定。由于PCR技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確和廉價等特點(diǎn)，可在數(shù)小時內(nèi)得出結(jié)果，目前廣泛應(yīng)用于PRV檢測工作中。其主要適用于檢測動物產(chǎn)品中感染PRV。PCR技術(shù)是目前最常用的PCR方法，采用PCR擴(kuò)增PRV病毒核酸片段可以達(dá)到準(zhǔn)確檢測目的。其方法如下：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過一系列步驟制備出含有陽性分子片段的PRV病毒序列片段，然后將序列片段經(jīng)無菌操作（滅菌后在37℃下保存）轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增試劑盒中等待檢測。

9、細(xì)菌檢測

目前有一種適用于豬場所有豬只PRV檢測的PCR擴(kuò)增裝置獲得了FDA批準(zhǔn)，可以用于病豬臨床診斷和防控效果驗(yàn)證。通過將PRV陰性細(xì)胞或蛋白接種于含有PRV抗原的PRV培養(yǎng)基中，通過PCR擴(kuò)增等實(shí)驗(yàn)方法將抗原直接導(dǎo)入細(xì)菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)檢測，具有速度快、操作簡單、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

總之，豬捷申病毒的危害性較高，目前豬捷申病毒檢測技術(shù)在我國多個地區(qū)得到應(yīng)用，但由于PRV具有很強(qiáng)的致病性，需要采用不同方法來進(jìn)行檢測分析，以鑒別其感染性、鑒別診斷PRV感染性與偽狂犬病毒的感染性樣變種。通過實(shí)驗(yàn)室檢測方法的進(jìn)一步完善，能夠更加全面為養(yǎng)殖行業(yè)的健康發(fā)展提供幫助，做到提前預(yù)防，進(jìn)而為食品安全打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

（作者單位：1.536000廣西壯族自治區(qū)北海市動物疫病預(yù)防控制中心；2.536126廣西壯族自治區(qū)北海市合浦縣常樂鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)和鄉(xiāng)村振興服務(wù)中心）