褪黑素預處理對草莓苗耐旱性的影響

摘要：為研究外源褪黑素預處理對草莓苗耐旱性的影響，以草莓苗為試驗材料，用不同濃度褪黑素對草莓苗“噴施+灌根”預培養后再進行干旱處理。結果表明，干旱嚴重抑制草莓生長，中低濃度（100～200 μmol/L）褪黑素預處理能夠有效緩解干旱對草莓苗造成的生長脅迫，增強超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）的活性，抑制過氧化氫（H2O2）和丙二醛（MDA）的產生。同時，干旱脅迫使草莓苗逆境相關基因的表達量升高，外源褪黑素預處理能進一步提高其表達水平，并顯著影響褪黑素合成途徑關鍵酶基因的表達，以提高草莓苗的耐旱性。

關鍵詞：草莓苗；褪黑素；干旱脅迫；抗氧化；逆境基因表達

中圖分類號：S668.4；Q945.78" " " " "文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）08-0095-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.08.015 開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Effects of melatonin pretreatment on drought resistance of strawberry seedlings

GOU Yi-jie， YANG Zhen-hua

（Strawberry Engineering Technology Research Center， Yangling Vocational amp; Technical College， Yangling" 712100， Shaanxi， China）

Abstract： In order to study the effects of melatonin pretreatment on drought resistance of strawberry seedlings， strawberry seedlings were treated with different concentrations of melatonin in “spray+root irrigation” pre-culture before drought treatment. The results showed that drought severely inhibited strawberry growth. Medium and low concentration（100～200 μmol/L） melatonin pretreatment could effectively alleviate the growth stress caused by drought on strawberry seedlings， enhance the activities of superoxide dismutase（SOD）， peroxidase（POD） and catalase（CAT）， and inhibit the production of hydrogen peroxide （H2O2） and malondialdehyde（MDA）. Meanwhile， drought stress increased the expression levels of stress-related genes in strawberry seedlings， and exogenous melatonin pretreatment could further enhance the expression levels and significantly affect the expression of key enzyme genes of the melatonin synthesis pathway， so as to improve the drought resistance of the strawberry.

Key words： strawberry seedling； melatonin； drought stress； antioxidant； stress gene expression

水分對作物生長發育、產量和品質起著重要作用。隨著全球變暖，水資源短缺已成為全人類需共同面對的難題，干旱對植物造成的影響越來越大，干旱脅迫會破壞水分平衡， 植物細胞內活性氧含量增加， 發生氧化脅迫及膜脂過氧化加劇， 嚴重導致植株死亡［1］。草莓（Fragaria vesca L.）因其果實有極高的營養價值而素有“水果皇后”的美稱，但草莓根系入土淺，不耐旱， 需水量多，喜濕又不耐澇，管理不當極易造成干旱脅迫， 如何提高草莓的抗旱性是草莓相關研究的熱點之一。

褪黑素（Melatonin，MT）是一種吲哚胺類植物生長調節因子和生物刺激因子，在植物體內廣泛存在，與吲哚乙酸（IAA）具有相同的初始化合物色氨酸，可作為一種防御信號來緩解不同逆境條件對植物引起的傷害。褪黑素通過緩解氧化脅迫和抑制滲透脅迫提高植物對干旱、高溫、低溫、高鹽、重金屬等非生物脅迫的抗性，同時通過調控非生物脅迫相關的信號通路的基因表達來提高植物抗逆性［2，3］。然而，與褪黑素在動物上的相關研究相比，褪黑素在植物中的相關研究相對較少，褪黑素在植物上的應用有很大的潛力尚未被發現和研究［4］。賀嘉豪等［5］研究了不同程度干旱脅迫條件下噴施外源褪黑素對煙草幼苗的影響效應，發現噴施外源褪黑素能顯著提高煙草幼苗的光合能力，增加滲透調節物質的積累，降低活性氧和過氧化物的含量，減輕氧化損傷，以及增強抗氧化酶活性；厲恩茂等［6］發現，在人為控水的干旱條件下噴施100 mg/kg褪黑素能緩解干旱對蘋果幼苗的影響，提高蘋果幼苗的抗旱性；呂夏晨等［7］發現干旱脅迫下，外源褪黑素對大麥幼苗的抗氧化物質具有調節作用，并通過調控蠟質基因的表達增強大麥抗旱性。利用褪黑素提高植物抗逆性在生產中具有重要的應用潛力。目前， 關于褪黑素調節草莓苗耐旱性的相關研究鮮有報道，為此，試驗以盆栽紅顏草莓為試驗材料，通過研究草莓苗葉片對干旱的生理響應、褪黑素合成途徑關鍵酶基因及逆境相關基因的表達，研究褪黑素預處理對草莓苗耐旱性的影響，以期為提高干旱、半干旱地區草莓生產的經濟效益提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

紅顏草莓苗于2022年4月15日采自楊凌職業技術學院農林綜合實訓基地。

1.2 試驗處理

草莓苗于基質（草炭、蛭石、珍珠巖體積比為9∶3∶1）中培養，并于光照培養箱中緩苗兩周，光/暗周期16 h/8 h， 溫度20～25 ℃，相對濕度70%～80%， 光照度為400 μmol/（m2·s）。待草莓苗長至“四葉一心”時進行外源MT和干旱處理。MT處理方式為葉面噴施和灌根相結合，MT濃度分別為：0（去離子水）、100、200、400 μmol/L（簡寫為0 MT、100 MT、200 MT、400 MT）。連續處理3次，每次間隔3 d。處理結束后，0 MT處理選取一半植株作為對照（CK）進行正常水分管理，其余植株進行干旱處理。干旱處理3 d后，剪取葉片組織用于相關基因表達水平的定量檢測；干旱處理10 d后，剪取葉片組織用于生理生化相關指標的檢測。每個處理各10株，3次重復。

1.3 生長指標和生物量的測定

每個處理分別挑選5株長勢一致的草莓苗，用卷尺測量株高（植株基部至葉片最高處之間的距離）及葉柄長（心葉向外第3片展平的功能葉的葉柄長度）；之后將地上部和地下部分開清洗干凈，放入烘箱，于105 ℃下殺青15 min后，在80 ℃ 烘至恒重，稱取干重。根冠比=地下部干重/地上部干重。

1.4 生理生化指標測定

過氧化氫（H2O2）含量參照過氧化氫試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）說明書進行測定；丙二醛含量采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定。相對電導率采用浸泡法，通過DDSJ-308A電導率儀測定；超氧化物歧化酶（SOD）測定采用氮藍四唑（NBT）光化學還原法；過氧化物酶（POD）測定采用愈創木酚法；過氧化氫酶（CAT）測定采用H2O2氧化還原法。所有指標均以鮮重計。

1.5 不同濃度MT處理干旱脅迫下草莓苗褪黑素合成途徑關鍵酶相關基因及逆境相關基因的表達

1.5.1 總RNA的提取及cDNA的合成 用多糖多酚植物RNA提取試劑盒提取各樣品草莓苗葉片總RNA，再用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，反應體系：1 μg總RNA，4 μL 5×Fastking-RT SuperMix，RNasefree ddH2O定容到20 μL。42 ℃反應15 min，95 ℃保持3 min終止反應。獲得的cDNA產物稀釋5～10倍， 用于qRT-PCR或-20 ℃保存備用。

1.5.2 特異性引物的設計 根據文獻報道及TAIR擬南芥數據庫篩選逆境相關基因及褪黑素合成途徑關鍵酶相關基因， 并在NCBI中比對找到草莓中的同源基因序列。根據實時熒光定量PCR的引物設計原則，利用SnapGene軟件設計引物，具體見表1。

1.5.3 基因的qRT-PCR及數據分析 采用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad，USA）進行各基因的qPCR分析。熒光定量PCR反應體系（10 μL）：5 μL SYBR Green Fast qPCR Master Mix （BBI），上游、下游引物各0.5 μL，2 μL cDNA，2 μL無菌水。實時熒光定量PCR程序：95 ℃預變性10 s，95 ℃解鏈5 s，55 ℃退火并延伸30 s，40個循環，FaACTIN作為內參，根據2-ΔΔC法，以對照組為參考進行歸一化處理，計算基因的相對表達量。

1.6 數據處理

采用Microsoft Excel 2007和IBM SPSS Statistics Version 19進行數據統計與分析，采用GraphPad Prism 9進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 褪黑素預處理對干旱脅迫下草莓苗生長指標和生物量的影響

如圖1所示，干旱條件下草莓苗的生長受到抑制，褪黑素的施加緩解了這種抑制，0 MT處理下，草莓植株10 d后葉片全部枯萎失水，100 MT、200 MT、400 MT處理均對上述生長不良情況有所緩解，其中200 MT處理下緩解效果最明顯，植株生長未受明顯影響。

褪黑素預處理對草莓苗生長指標和生物量結果（表2）顯示，與CK正常澆水處理相比， 干旱處理10 d后，100 MT處理和400 MT處理下，株高、葉柄長、地上部干重、地下部干重均顯著下降， 褪黑素預處理緩解了以上指標的下降趨勢。不同濃度MT預處理的草莓苗在干旱處理10 d后差異較大，200 MT預處理的植株在干旱條件下表現良好，株高19.08 cm、葉柄長11.18 cm，均優于其他濃度MT處理的植株。進一步測定地上部、地下部干重發現，干旱處理使草莓苗植株干物質含量顯著下降，200 MT預處理的植株在干旱條件下地上部、地下干重分別為3.74、3.71 g，均高于其他濃度MT處理的植株。根冠比是反映植株生長狀態的重要指標之一，4個褪黑素處理組與對照組相比根冠比有所提高，但" " 0 MT、100 MT、200 MT處理間差異不顯著。

2.2 褪黑素預處理對干旱脅迫下草莓苗相對電導率及過氧化物（H2O2、MDA）含量的影響

相對電導率可反映植株受損程度，如圖2a所示，相比CK組，干旱處理10 d后，4組處理的相對電導率均顯著上升；0 MT處理的相對電導率為37.08%，植株受損程度最嚴重，100 MT、200 MT、 400 MT處理的相對電導率均顯著下降，其中200 MT處理的電導率最低，為22.8%，植株受損程度最小。植株在逆境脅迫過程中會伴隨產生過氧化物（H2O2、MDA），如圖2b、2c，H2O2含量和MDA含量在干旱處理后均顯著增加，褪黑素預處理能顯著抑制H2O2和MDA的產生，兩者的抑制效果最佳處理組均為" "200 MT，褪黑素預處理可減輕逆境下植株組織過氧化損傷程度，對植株有一定的保護作用。

2.3 褪黑素預處理對干旱脅迫下草莓苗抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性的影響

抗氧化酶類在植物抗逆反應中起著重要的作用。SOD在抗氧化酶類中處于核心地位，其能夠迅速參與清除活性氧，如圖3a，與CK相比，干旱脅迫后SOD活性顯著提高， 褪黑素預處理能夠進一步提高SOD活性，200 MT和400 MT處理組效果明顯。POD在H2O2等氧化物的水解反應中發揮重要作用，如圖3b，與CK相比，褪黑素預處理能夠進一步提高POD活性，200 MT和400 MT處理組效果顯著，其中200 MT處理組的POD活性顯著高于其他處理組。CAT是一種穩定的過氧化氫分解酶，如圖3c，與CK相比，干旱脅迫下CAT活性顯著提高，100 MT、" "200 MT、400 MT 褪黑素預處理能進一步提高CAT活性， 但相互間無顯著差異。

2.4 褪黑素預處理對干旱脅迫下草莓苗逆境相關基因及褪黑素合成酶相關基因表達的影響

如圖4所示，經過褪黑素預處理的草莓苗經受干旱脅迫后，鈣信號基因FaCDPK1、轉錄因子（FaERF071、FaRAP2.12、FaRAP2.3、FaDREB1A、FaDREB2A）、胚胎細胞發育相關基因FaLEA、水通道蛋白基因FaPIP1及褪黑素合成關鍵酶相關基因（FaSNAT、FaASMT、FaTDC、FaT5H）均成功檢測，且表達量存在差異。鈣信號是物體內重要的第二信使分子，參與調控眾多的細胞生物學活動和過程，受干旱脅迫后鈣信號基因FaCDPK1表達量顯著上調，100 MT、200 MT褪黑素處理對其表達量增強效果最強。轉錄因子ERF、RAP和DREB都與植物抗逆響應相關，干旱處理之后，草莓苗FaERF、FaRAP和FaDREB均上調表達，推測除乙烯外，褪黑素作為信號分子也影響著ERF行使功能。LEA和PIP1在保護細胞免受非生物脅迫和維持植物正常生長發育過程中發揮重要作用，干旱脅迫后，草莓苗FaLEA和FaPIP1表達量顯著上升， 外源褪黑素能夠進一步促進相關蛋白積累。FaSNAT和FaASMT的表達量在干旱脅迫后表達量上調，200 MT、400 MT褪黑素處理下其表達量顯著升高。FaTDC的表達量在干旱脅迫后顯著上升， 外源褪黑素能夠進一步促進其表達。FaT5H的表達嚴重受到干旱脅迫的抑制， 外源褪黑素對其表達水平也無恢復促進作用。由此表明，內源褪黑素的合成受到外源褪黑素的促進作用， 但在不同合成階段的影響效果有較大差異。

3 小結與討論

褪黑素是一種多功能分子參與植物生理調節，在促進植物生長發育的同時也能夠減少逆境脅迫對植物的有害影響。干旱脅迫抑制植物的生長發育，而外源褪黑素可以減輕干旱誘導的生長抑制［8， 9］。本研究結果也支持這一結論，結果表明，外源褪黑素預處理后草莓苗狀態無明顯變化，但經干旱脅迫后，因受到水分虧缺的嚴重抑制，未施加褪黑素預培養的草莓苗已明顯失水萎蔫。褪黑素預處理后的草莓苗同樣出現萎蔫，但依舊有部分葉片保持活力，結合株高、葉柄長、地上部干重、地下部干重、根冠比等指標，表明褪黑素預處理能在一定程度上提高植株耐旱性，且具有劑量效應，在施加濃度為200 μmol/L外源褪黑素時效果最佳。類似的研究結果在前人的文章中也有所報道［10］。

相對電導率和丙二醛（MDA）水平與細胞膜結構的穩定性呈現負相關性，當植物體內的二者水平較高時表明其膜系統受損害嚴重。逆境脅迫下植物自身會產生ROS過度積累，從而觸發脂質過氧化反應，破壞細胞膜的通透性和完整性，導致細胞膜結構受損［11］。在本研究中，干旱脅迫導致草莓葉片的H2O2含量、丙二醛含量和相對電導率顯著上升。褪黑素預處理植株的以上指標增量顯著低于未預處理植株。此結果表明，外施褪黑素有利于保護草莓葉片在干旱脅迫下維持細胞膜功能完整性和細胞結構穩定性，這與前人在燕麥中的研究結果類似［12］。

在非生物脅迫中，ROS也可以作為信號分子激活由SOD、POD和CAT等酶構成的抗氧化保護系統［13］。前人研究表明，褪黑素具有很強的抗氧化能力，作為抗氧化劑在控制植物細胞中存在的活性氧以及其他自由基和有害氧化分子方面具有重要作用［13，14］。在本研究中，干旱脅迫下草莓SOD、POD和CAT活性顯著上升，褪黑素預處理植株的以上指標進一步提升。表明褪黑素預處理能夠提高草莓自身響應干旱脅迫的抗氧化能力。

植物在干旱脅迫下所發生的一系列生理生化變化，本質是其自身復雜的相關分子機制互作調控的結果。CDPK是一類Ser/Thr型蛋白激酶，其可以作為鈣離子的感受器直接被Ca2+信號激活，參與植物生長發育并調控抗逆性［15］。外源褪黑素顯著提高了FaCDPK1的表達，激活干旱脅迫響應反應，有效提高草莓苗的耐旱能力。DREB 轉錄因子參與調控逆境響應基因表達，介導非生物脅迫信號的轉導，DREB1型和DREB2型轉錄因子均參與調控植物響應干旱脅迫應答，過表達AtDREB1A、AtDREB2A顯著提高擬南芥對干旱的耐受性［16，17］。在本研究中，外源褪黑素顯著提高了FaDREB1A、FaDREB2A的表達，并且FaDREB2A的表達量存在劑量效應，隨著外源褪黑素濃度升高表達量逐漸增加。LEA和PIP是兩種功能蛋白，具有解毒、運輸離子的功能，轉錄因子DREB對它們有調控作用， 三者共同構成調控網絡， 響應干旱脅迫［18，19］。外源褪黑素能夠有效提高草莓苗二者表達水平。植物體內褪黑素的合成前體為色氨酸， 合成途徑共經過4步酶聯反應，這4個關鍵酶包括 SNAT（Serotonin N-acetyltransferase，N-乙酰血清素甲基轉移酶）、 ASMT（Acey lserotonin methyltransferase，乙酰血清素甲基轉移酶）、TDC（Tryptophan decarboxylase，色氨酸脫羧酶）、T5H（Tryptamine 5-hydroxylase，色胺5羥化酶）［20］，褪黑素合成酶相關基因的表達受逆境脅迫誘導［21］。研究表明，在植物中過表達褪黑素合成酶相關基因如ASMT、SNAT、TDC能增加轉基因植株體內MT的含量，提高植株抗逆性［22-24］，T5H較為特殊，過表達并不能影響植物體內褪黑素的含量［25］，ASMT、SNAT、TDC為褪黑素合成過程中的限速酶。干旱脅迫誘導了草莓苗FaTDC和FaASMT基因的表達，而對FaT5H基因表達有一定的抑制作用，外源褪黑素預處理能進一步加強這種刺激作用，從而有利于草莓苗內源褪黑素快速積累響應干旱脅迫。

綜上，褪黑素能夠提高抗氧化酶的活力， 抑制過氧化物的產成，因此干旱脅迫下外源褪黑素預處理能夠對草莓苗起到保護作用。在干旱脅迫下，外源褪黑素能夠強化逆境相關基因的表達，使草莓苗更好地適應干旱環境。本研究進一步證實了褪黑素作為新型植物激素通過生理和分子水平提高草莓耐旱能力的真實性，為提高植物耐旱性的研究提供了新思路。

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收稿日期：2023-02-13

基金項目：陜西省重點研發項目（2023-YBNY-043）；楊凌職業技術學院院內科學研究項目（ZK21-72）；陜西省科技廳一般項目“蔬菜溫室大棚智慧化種植管控技術研發與應用”（2022NY-217）

作者簡介：緱一杰（1995-），女，陜西延安人，助教，碩士，主要從事園藝學教學和草莓育種研究工作，（電話）18829355017（電子信箱）gouyijie1025@163.com；通信作者，楊振華，（電話）18092186348（電子信箱）kushi523@163.com。