蚊母樹葉癭蚜分子鑒定及種群遺傳分化研究

摘 要：為了明確我國(guó)蚊母樹葉片蟲癭致癭蚜蟲的種類及其種群遺傳分化情況，從湖南、重慶、江蘇、浙江4地區(qū)的蚊母樹葉癭蚜標(biāo)本中提取DNA進(jìn)行線粒體COI、COII基因片段序列分析，結(jié)合GenBank同源序列進(jìn)行了分子鑒定，并構(gòu)建了基于COI、COII基因序列的蚜蟲分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：南京中山植物園蚊母樹葉癭蚜基因片段序列與湖南省長(zhǎng)沙、婁底、永州種群的完全相同，即共享1個(gè)單倍型；重慶、杭州地理種群存在一定的遺傳分化，但仍以長(zhǎng)沙、南京標(biāo)本的單倍型為主，且各單倍型樣本之間的遺傳距離非常小。序列分析結(jié)果支持4地區(qū)6個(gè)城市的蚊母樹葉癭蚜均為蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis Matsumura），杭州新胸蚜（N. hangzhouensis）是蚊母新胸蚜的同物異名。

關(guān)鍵詞：蚊母樹；葉癭蚜；分子鑒定；同物異名

中圖分類號(hào)：S433.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）02-0016-04

Abstract： To identify the species of leaf gall-inducing aphids of Distylium racemosum in China and explore the population genetic differentiation， the COI and COII gene sequences of the leaf gall-inducing aphids of Distylium racemosum from Hunan， Chongqing， Jiangsu and Zhejiang were obtained by PCR amplification， and then were sequenced and compared with the homology sequences from GenBank. The phylogenetic trees based on COI and COII gene sequences of aphids were constructed by the NJ method. The results have shown that the samples from Nanjing， Changsha， Loudi and Yongzhou share the same unique haplotype. There is a certain genetic differentiation in the populations from Chongqing and Hangzhou， but the haplotype of the most samples is the same as that of Changsha and Nanjing populations， and the genetic distances among different haplotypes are extremely small. The results of sequence analyses reveal that all samples from six cities of four regions are Neothoracaphis yanonis Matsumura whose synonym is Neothoracaphis hangzhouensis Zhang.

Key words： Distylium racemosum; leaf gall-inducing aphid; molecular identification; synonym

蚊母樹（Distylium racemosum Sieb. et Zucc）隸屬于金縷梅科蚊母樹屬，是一種常綠灌木或中喬木，在華南、華中地區(qū)常作園林綠化植物，多年來(lái)一直受到蚜蟲的危害，在葉片上形成大量的蟲癭。前人研究發(fā)現(xiàn)，危害蚊母樹引起蟲癭的主要是蚊母新胸蚜/矢日本扁蚜（Neothoracaphis yanonis Matsumura）和杭州新胸蚜（Neothoracaphis hangzhouensis Zhang）[1-2]。

這2種蚜蟲形態(tài)、習(xí)性都非常相似，后者已被作為前者的次異名處理[3]。據(jù)報(bào)道，湖南長(zhǎng)沙、吉首等地危害蚊母樹引起葉片蟲癭的是蚊母新胸蚜[4-5]，江蘇南京市蚊母樹葉片上的蟲癭主要由杭州新胸蚜造成，其次是蚊母新胸蚜[2，6]。安徽省合肥市杭州新胸蚜同時(shí)危害蚊母樹（D. racemosum）和楊梅葉蚊母樹（Distylium myricoides Hemsl），引起蟲癭[7]。

雖然湖南吉首、安徽合肥等地都有蚊母樹葉片蟲癭的相關(guān)報(bào)道，但關(guān)于蚊母樹葉癭蚜形態(tài)學(xué)、分子鑒定的文章鮮見報(bào)道，關(guān)于各地蚊母樹葉癭蚜種群之間親緣關(guān)系或遺傳分化的研究也未見報(bào)道。為了快速鑒定湖南婁底等地的蚊母樹葉癭蚜類別，明確蚊母樹葉癭蚜各地理種群的遺傳距離和親緣關(guān)系，筆者收集了湖南、重慶、江蘇、浙江4地區(qū)的蚊母樹葉癭蚜標(biāo)本，提取其DNA進(jìn)行線粒體COI、COII基因片段序列分析，結(jié)合GenBank同源序列進(jìn)行了分子鑒定，并構(gòu)建了基于COI、COII基因序列的蚜蟲分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采集的蚊母樹葉癭蚜基本信息見表1，將標(biāo)本保存在75%酒精中。COI引物：上游，5′- GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG -3′；下游，5′- TAAACTTCAGGCTGACCAAAAAATCA -3′。COII引物：上游，5′-CATTCATATGCAGAATTACC -3′；下游，5′- GAGATCGTTACTTTGCT TTT-3′。引物由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總DNA提取 參照何衍彪等[8]的方法，采用TIANamp Genomic DNA Kit血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行樣本總DNA的提取。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定 PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×Buffer 2.5 μL，MgCl2（25 mmol/L）1.75 μL，dNTP 2.25 μL，上、下游引物（10 pmol/μL）各1.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，模板DNA 2～3 μL，剩余體積由ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，34個(gè)熱循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)以ddH2O代替模板DNA作空白對(duì)照。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.2.3 DNA序列數(shù)據(jù)處理 用DNAstar軟件中的Editseq程序進(jìn)行序列編輯，用Clustal X 2.0軟件中的Align程序進(jìn)行DNA同源序列比對(duì)，并人工核對(duì)校正。從GenBank中下載了相關(guān)物種的COI、COII同源序列共18條（表2）一起進(jìn)行比較分析。通過(guò)MEGA 6.0軟件計(jì)算出各葉癭蚜種群間的遺傳距離，以NJ鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 我國(guó)蚊母樹葉癭蚜的發(fā)生情況及形態(tài)

蚊母樹以前是一種廣泛分布（或種植）的園林綠化植物，目前在湖南、重慶比較常見，其他省份很多城市都已經(jīng)不再種植。葉癭蚜在我國(guó)蚊母樹各種植區(qū)（生長(zhǎng)區(qū)）均有發(fā)生，除了危害蚊母樹外還可以危害楊梅葉蚊母樹，但幾乎不危害小葉蚊母樹[Distylium buxifolium（Hance）Merr]。

在湖南，3月蚊母樹蟲癭初為黃綠色凸起，后變成紫紅色球狀蟲癭，內(nèi)有1頭橙黃色干母成蟲和數(shù)量不等的黃色遷移蚜若蟲。4月上旬蟲癭基本成型，內(nèi)常有數(shù)十頭橘黃色至橙黃色3齡若蟲，4月中下旬開始出現(xiàn)遷移蚜成蟲。遷移蚜成蟲卵圓形，體長(zhǎng)1.6～2.0 mm，頭、胸棕色至黑褐色，腹部橙黃色；觸角5節(jié)；前翅寬闊，翅痣短，中脈一分叉，后翅有斜脈，靜止時(shí)翅平疊于背面。

2.2 不同地理類群葉癭蚜的分子鑒定及遺傳分化

從長(zhǎng)沙、婁底、永州、南京、重慶、杭州6個(gè)地點(diǎn)采集的蚊母樹葉癭蚜標(biāo)本中，各隨機(jī)提取了30頭蚜蟲的DNA進(jìn)行COI、COII基因擴(kuò)增，獲得了長(zhǎng)度分別為658、625 bp的序列，序列登錄號(hào)分別為ON227503～ON227508、ON227509～ON227514。對(duì)比發(fā)現(xiàn)，６個(gè)城市的蚊母樹葉癭蚜COI、COII基因片段序列差異非常小，重慶、杭州部分個(gè)體的COI基因片段序列第581位堿基存在差異，部分個(gè)體的COII基因片段序列中第381或681位堿基存在差異。

分析不同種群的COI、COII基因片段序列（表3）可知，６個(gè)城市的蚊母樹葉癭蚜共發(fā)現(xiàn)5個(gè)單倍型（其中COI 2個(gè)、COII 3個(gè)），長(zhǎng)沙、婁底、永州、南京的蚊母樹葉癭蚜共享同一單倍型（CCT型），重慶、杭州蚊母樹部分葉癭蚜發(fā)生了遺傳分化，但種群個(gè)體仍然以CCT型為主；單倍型TTC和TCT只在重慶種群中被發(fā)現(xiàn)；單倍型TCC和CCC只在杭州種群中被發(fā)現(xiàn)。

COI 的2個(gè)單倍型基因序列與GenBank收錄的同源序列比對(duì)結(jié)果（圖1）顯示，蚊母樹葉癭蚜單倍型C型標(biāo)本COI基因片段序列（ON227504）與GenBank中蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis）福州標(biāo)本（MH820606）同源序列完全一致（相似度100%），二者與蚊母樹葉癭蚜單倍型T型標(biāo)本（ON227508）聚為一支，其次是與我國(guó)蚊母新胸蚜另一地理種群標(biāo)本（JX489642）聚為一支，最后與同屬的Neothoracaphis quercicola（MN167415）聚為一大支。

COII的3個(gè)單倍型基因序列與GenBank收錄的的同源序列比對(duì)結(jié)果（圖2）顯示，蚊母樹葉癭蚜單倍型TC型標(biāo)本COII基因片段序列（ON227513）與蚊母樹葉癭蚜單倍型CC型標(biāo)本COII基因片段序列（CQWM ON227514）聚為一支，二者與GenBank中收錄的蚊母新胸蚜我國(guó)某地標(biāo)本（KP722574）聚為一支，最后與蚊母樹葉癭蚜單倍型CT型標(biāo)本COII基因片段序列（ON227510）聚為一大支。CT型、TC型和CC型蚊母樹葉癭蚜COII基因片段序列與蚊母新胸蚜我國(guó)某地標(biāo)本（KP722574）的同源序列相似度分別為99.67%、99.67%和99.50%。

由表4可知，6個(gè)城市的蚊母樹葉癭蚜遺傳分化總體不明顯，基于COI+COII基因序列的5個(gè)單倍型之間的遺傳距離僅為0.001～0.002。

3 結(jié)論與討論

由于線粒體DNA（mtDNA）屬于母系遺傳，在種群內(nèi)和種群間具多態(tài)性，在個(gè)體水平上具異質(zhì)性，因此被大量地應(yīng)用于研究昆蟲進(jìn)化和種群遺傳學(xué)；同時(shí)，COI、COII等線粒體DNA常被應(yīng)用于區(qū)分和鑒定親緣關(guān)系很近的分類單元或微小昆蟲[9]。湖南省（永州市、婁底市、長(zhǎng)沙市）蚊母樹葉癭蚜COI基因片段序列與GenBank中收錄的蚊母新胸蚜（Neothoracaphis yanonis）福州標(biāo)本（MH820606）同源序列完全一致[10]，COII基因片段序列與GenBank中收錄的蚊母新胸蚜（N. yanonis）我國(guó)某地標(biāo)本（KP722574）同源序列相似度也高達(dá)99.67%，足以證明婁底市蚊母樹葉癭蚜為蚊母新胸蚜。

杭州新胸蚜是張廣學(xué)教授于1982年發(fā)現(xiàn)的新種，分布于杭州、上海、南京、武漢，是南京地區(qū)危害蚊母樹蚜蟲的優(yōu)勢(shì)種[2，6，11]。其與蚊母新胸蚜的特征差異主要表現(xiàn)為頭頂毛、腹部背片背毛與觸角節(jié)最寬直徑的比例，觸角節(jié)鞭部頂端、喙節(jié)毛的數(shù)量，以及跗節(jié)毛序等方面[10]。Chen等[3]認(rèn)為蚊母新胸蚜、杭州新胸蚜在形態(tài)、習(xí)性方面都非常相似，可將它們互為同物異名。

研究發(fā)現(xiàn)，南京中山植物園蚊母樹葉癭蚜COI、COII基因片段序列與湖南省（永州、婁底、長(zhǎng)沙）的完全相同，說(shuō)明這些樣本均為蚊母新胸蚜。重慶、杭州地理種群存在一定的遺傳分化，但仍以長(zhǎng)沙、婁底、永州、南京標(biāo)本的單倍型（CCT型）為主，且各單倍型樣本之間的遺傳距離非常小。因此，研究中采自重慶和杭州的樣本也是蚊母新胸蚜。

從標(biāo)本采集范圍來(lái)看，郭昆[11]對(duì)中國(guó)扁蚜科的系統(tǒng)分類研究所采用的蚊母樹葉癭蚜標(biāo)本主要來(lái)自于江蘇、浙江，而廖文宇等[5]僅僅對(duì)長(zhǎng)沙的蚊母樹葉癭蚜進(jìn)行了分子鑒定。該研究采集的標(biāo)本分布于湖南、重慶、浙江、江蘇4地區(qū)，采樣點(diǎn)經(jīng)緯度跨度較大，采集的標(biāo)本基本能代表我國(guó)蚊母樹葉癭蚜種群遺傳結(jié)構(gòu)。根據(jù)６個(gè)城市蚊母樹葉癭蚜的COI、COII基因片段序列及各單倍型的分布情況，從分子水平上證明6個(gè)城市的蚊母樹葉癭蚜與GenBank

2019收錄的福州標(biāo)本均為蚊母新胸蚜，杭州新胸蚜是蚊母新胸蚜的同物異名。分子鑒定只是物種鑒定的一個(gè)輔助手段，如果能將張廣學(xué)教授所鑒定的杭州新胸蚜模式標(biāo)本COI、COII序列與其他各地蚊母樹葉癭蚜標(biāo)本的進(jìn)行比對(duì)、分析，其結(jié)果對(duì)于蚊母新胸蚜、杭州新胸蚜的分類地位的確定將更加具有說(shuō)服力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 沈百炎. 矢日本扁蚜的初步觀察與防治[J]. 植物保護(hù)，1986，12（6）：16-17.

[2] 沈百炎，荊建玲，朱建國(guó). 杭州新胸蚜生物學(xué)的初步研究[J]. 植物保護(hù)，1993，19（2）：5-7.

[3] CHEN J，JIANG L Y，QIAO G X. Revision of Neothoracaphis Takahashi with description of a new species from China（Hemiptera：Aphididae：Hormaphidinae）[J]. Oriental Insects，2011，45（2/3）：146-161.

[4] 李曉騰，劉世彪，張世鑫，等. 中華蚊母樹蟲癭類型及其致癭昆蟲生活史初探[J]. 昆蟲知識(shí)，2010，47（4）：789-793.

[5] 廖文宇，吳海龍，張?jiān)婈桑? 長(zhǎng)沙地區(qū)7種寄主蚜蟲的快速鑒定及其親緣關(guān)系分析[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2019，39（6）：12-21.

[6] 巨云為，朱 萍，施大偉，等. 蚊母樹對(duì)杭州新胸蚜蟲癭形成的生理生化響應(yīng)[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2012，32（1）：10-12.

[7] 陳 辰. 杭州新胸蚜對(duì)2種蚊母樹的危害性比較研究[D]. 合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[8] 何衍彪，萬(wàn)宣伍，詹儒林，等. 基于核糖體基因18S和28S序列的12種粉蚧親緣關(guān)系解析[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，2011，32（12）：2324-2330.

[9] 張民照，杜艷麗，張愛環(huán)，等. 線粒體DNA標(biāo)記在昆蟲學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)展[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，26（1）：76-80.

[10] LI Q，DENG J，CHEN C，et al. DNA barcoding subtropical aphids and implications for population differentiation[J]. Insects，2019，11（1）：11.

[11] 郭 昆. 中國(guó)扁蚜科的系統(tǒng)分類研究（同翅目：蚜總科）[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2005.

（責(zé)任編輯：成 平）