蘿卜HAK/KUP/KT基因家族鑒定與表達特性分析

摘要： 鉀元素是植物生長發育過程中必需的主要礦質營養元素之一，對作物的產量和品質有決定性影響，細胞內K+含量水平在很大程度上受K+轉運蛋白控制。通過生物信息學方法從全基因組水平鑒定出蘿卜K+轉運蛋白HAK/KUP/KT基因家族成員，并對其基因結構、蛋白質特性、保守基序、染色體定位、啟動子順式作用元件、系統進化及表達特性等進行分析。結果表明，鑒定出的17個蘿卜HAK/KUP/KT基因不均等地分布在蘿卜6條染色體及Scaffold00840上，根據與擬南芥的同源關系將其命名為RsHAK1～RsHAK17；RsHAKs基因結構、保守基序、蛋白質理化特性等均具有高度保守性，啟動子區域存在大量與環境因素、植物激素、逆境脅迫應答等有關的順式作用元件；系統進化分析結果顯示，17個RsHAKs基因聚為4個亞家族，全基因組復制事件是RsHAKs基因擴張的主要驅動力。轉錄組和qRT-PCR表達分析結果表明，除RsHAK5僅在蘿卜根部表達外，其他RsHAKs在蘿卜各器官及發育過程中均有特異性表達，且在高鉀滲透脅迫下在葉片中相對表達量顯著上調，RsHAK3、RsHAK9、RsHAK11和RsHAK12在根部呈現明顯的缺鉀誘導表達模式。研究結果為進一步全面解析HAK/KUP/KT基因在蘿卜中的生物學功能以及提高蘿卜栽培品質提供了一定理論依據。

關鍵詞： 蘿卜；鉀轉運蛋白；基因家族；K+；表達分析

中圖分類號： S631.1 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0777-11

Identification and expression characteristics analysis of HAK/KUP/KT gene family in radish

CHENG Rui1，2， WANG Guo-lian1，2， SUN Yu-dong1，2， WANG Lin-chuang1，2， LUO De-xu1，2， WANG Wei1，2， ZHONG Xiu-juan1，2， ZHAO Jian-feng1，2

（1.Huaiyin Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Region of Jiangsu/Huaian Key Laboratory for Facility Vegetables， Huaian 223001， China;2.Huaiyin Normal University/Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology Around Hongze Lake， Huaian 223001， China）

Abstract： Potassium is one of the essential main mineral nutrient elements in the process of plant growth and development， and has a decisive impact on the yield and quality of crops. The level of intracellular K+ content is largely controlled by K+ transport proteins. Members of the radish K+ transport protein related HAK/KUP/KT gene family were identified from whole genome-wide level by bioinformatics methods， and the gene structure， protein properties， conserved motifs， chromosomal localization， promoter cis-acting elements， phylogenetic evolution and expression characteristics were analyzed. The results showed that the 17 radish HAK/KUP/KT genes were unequally distributed on six chromosomes and Scaffold00840， and were named RsHAK1-RsHAK17 according to their homology with Arabidopsis. The gene structure， conserved motifs， physicochemical properties of proteins of RsHAKs genes were highly conserved， and there were a large number of cis-acting elements related to environmental factors， plant hormones and responses to adversity stresses in the promoter region. Phylogenetic analysis showed that 17 RsHAKs genes clustered into four subfamilies， and whole genome-wide replication events were the main driver of the RsHAKs genes expansion. The results of transcriptome and qRT-PCR expression analysis showed that except for RsHAK5， which was only expressed in radish roots， other RsHAKs were specifically expressed in different organs and different development processes of radish， and the relative expression in leaves was significantly up-regulated under high potassium osmotic stress. RsHAK3， RsHAK9， RsHAK11 and RsHAK12 showed obvious expression patterns induced by potassium deficiency in roots. Overall， the results provide theoretical basis for further comprehensive analysis of the biological functions of HAK/KUP/KT gene and improving the cultivation quality of radish.

Key words： radish；potassium transport protein；gene family；K+；expression analysis

鉀元素是植物體內新陳代謝所必需的主要礦質營養之一，參與氣孔運動、細胞生長、信號轉導、滲透調節和質膜電位的維持等，在植物生長發育和抵御逆境脅迫中起重要作用[1-2]。植物吸收鉀離子（K+）有2套運輸系統，即K+通道和K+轉運蛋白[3-4]。HAK/KUP/KT（high-affinity K+/K+ uptake permease/K+ transporter）作為植物體內最大的K+轉運蛋白家族，在植物生長調控、養分代謝、逆境應答等過程中發揮至關重要的作用[5]。自1997年研究人員從大麥中克隆出第一個植物鉀轉運蛋白編碼基因HAK1[6]以來，迄今已有水稻[7]、小麥[8]、玉米[9]、大豆[10]、馬鈴薯[11]、油菜[12]、木薯[13]、番茄[14]、辣椒[15]、梨[16]、石榴[17]、香蕉[18]等作物通過全基因組分析鑒定出HAK/KUP/KT家族成員。HAK/KUP/KT基因一般含有10～15個跨膜區域，具有保守的K+轉運結構域（K+-trans）[19-20]，主要定位于細胞膜系統，在植物的根、莖、葉和果實等器官中均有表達[21]。已有研究結果表明，HAK/KUP/KT家族成員包含4個亞家族（Ⅰ～Ⅳ），每個亞家族均有較為保守的結構和功能[7]。亞家族Ⅰ基因主要在根中表達，參與植物根系對環境中K+的吸收、運輸[22-23]；亞家族Ⅱ基因主要參與植物的生長調節等生理過程[24]；亞家族Ⅲ和Ⅳ的功能研究報道較少[16]。

蘿卜（Raphanus sativus L.）是重要的十字花科蔬菜之一，其營養豐富，藥用價值高，被譽為“小人參”，在中國蔬菜生產中占有重要地位。中國是世界第一蘿卜種植大國，栽培面積近1.2×106 hm2，約占世界蘿卜栽培總面積的40%[25]。鉀元素對果蔬品質的形成具有重要影響，然而，尚不清楚蘿卜對鉀的吸收利用機制。目前，HAK/KUP/KT在多種園藝作物中已有報道，但在全基因組水平對蘿卜HAK/KUP/KT基因的鑒定和分析未見報道。蘿卜基因組數據庫的公布和不斷完善[26-27]為在全基因水平鑒定和分析蘿卜HAK/KUP/KT基因提供了重要基礎。本研究對蘿卜基因組中的HAK/KUP/KT基因家族成員進行鑒定，并對其基因結構、蛋白質特征、保守基序、染色體定位、啟動子順式作用元件、系統進化及表達特性等進行分析，為進一步研究蘿卜HAK/KUP/KT基因家族成員的生物學功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 蘿卜HAK/KUP/KT家族成員的鑒定

蘿卜基因組數據信息從已公布的蘿卜基因組數據庫（http：//radish-genome.org）中獲取[28]。擬南芥和水稻的HAK/KUP/KT家族基因編碼的蛋白序列分別從擬南芥數據庫TAIR（http：//www.arabidopsis.org）、水稻基因組數據庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）中獲得。以擬南芥13個HAK/KUP/KT蛋白序列作為靶序列，在蘿卜基因組數據庫中進行BLASTP比對，篩選閾值為1×e-10，初步獲得蘿卜HAK/KUP/KT基因家族候選成員。采用ORF（Open Reading Frame，開放閱讀框）Finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi）對候選基因序列ORF的完整性進行分析，剔除沒有完整ORF的基因；進一步通過Pfam數據庫（http：//pfam.sanger.ac.uk/）進行K+轉運保守結構域（PF02705）驗證，并利用NCBI數據中CDD（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）在線軟件復篩，最終確定蘿卜HAK/KUP/KT家族成員，并統一使用RsHAK進行命名。

1.2 蘿卜RsHAK蛋白理化特性及基因序列特征分析

利用在線軟件Expasy（http：//www.expasy.org）對蘿卜RsHAK蛋白序列的相對分子質量、理論等電點、不穩定系數、親水性（GRAVY）等進行分析；利用WoLFPSORT（http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html）對蘿卜RsHAK進行亞細胞定位預測；利用軟件TMHMM Server.2.0（http：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ TMHMM-2.0）進行RsHAKs跨膜結構域分析；利用在線軟件MEME（http：//meme.nbcr.net/meme/tools/meme）分析蘿卜RsHAKs蛋白保守基序（Motif）[29]，并利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和Pfam數據庫對Motif序列進行注釋分析。

染色體信息從蘿卜基因組數據庫獲得，蘿卜RsHAKs基因染色體定位圖利用軟件TBTools繪制[30]。基因內含子/外顯子結構分布利用GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn）進行分析[31]。啟動子序列信息以起始密碼子上游2 000 bp的核酸序列進行分析，利用PLACE平臺（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）進行預測[32]。

1.3 蘿卜RsHAK系統進化樹構建及基因復制事件分析

利用軟件CLUSTALW和MEGA 7.0對蘿卜、擬南芥和水稻HAK/KUP/KT蛋白進行多重比對，基于鄰接法（Neighbor-joining method，NJ method）構建系統發育樹，Bootstrap設定為1 000。使用MCScanX軟件識別RsHAK基因的重復事件[33-34]。

Ka（非同義替換率）、Ks（同義替換率）和Ka/Ks值使用KaKs_Calculator 2.0軟件進行計算[35]，并利用K值預算復制事件發生的時期（T）（T=Ks/2λ）[34]。本研究中，我們假設蘿卜同義替換的λ值為5.9×10-9[26-28]。

1.4 蘿卜RsHAK時空表達分析

為分析RsHAK在蘿卜生長發育過程中及各器官中的表達模式，從已公布的蘿卜參考基因組數據庫中下載相關RNA-seq數據。每個RsHAK基因的表達水平通過FPKM（Fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）方法表示。RsHAKs基因時空表達熱圖利用R包pheatmap進行分析繪制。

1.5 RsHAK在缺鉀和高鉀脅迫下的表達模式分析

以江蘇淮安地方蘿卜品種紫芽青為試驗材料。使用50孔穴盤進行育苗，待幼苗生長至2～3張真葉時，選取長勢相對一致的蘿卜幼苗，用清水小心沖洗根部基質，開始水培。每7 d換１次營養液，調整pH值為7.0±0.1，采用改良的Hoagland營養液配方進行水培[16，36]，以K+濃度0 mmol/L為缺K+處理，以3倍K+濃度（18 mmol/L）高滲Hoagland營養液為高K+脅迫處理，并保持氮、磷等其他營養元素一致，具體試驗方法參照Wang等[16]的方法。處理15 d后分別收集蘿卜根部和葉片樣品備用。采用Trizol法提取樣品總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA。基因的特異引物（表1）利用美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫在線軟件Primer designing tool（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）設計，其中，RsHAK14和RsHAK15的編碼區序列完全一致，無法設計特異性引物。利用熒光定量PCR技術分析RsHAKs在正常培養、缺K+和高K+脅迫條件下，在紫芽青蘿卜地上部分及地下部分的相對表達量，試驗具體參數參考孫小川等[25]的研究。

2 結果與分析

2.1 蘿卜RsHAK基因家族鑒定及理化特性分析

在蘿卜RsHAK基因家族中共鑒定出17個RsHAKs基因，通過NCBI和Pfam數據庫進一步驗證后，根據與擬南芥HAK/KUP/KT家族成員之間的同源關系將蘿卜RsHAK基因分別命名為RsHAK1～RsHAK17（表2）。17個RsHAKs基因分布在蘿卜染色體2、染色體3、染色體4、染色體6、染色體7、染色體8、染色體9和Scaffold00840（基因支架）上（圖1），具有高度保守性，均具有13～14個跨膜區，編碼區序列（CDS）長度為2 148～2 598 bp，編碼氨基酸數為715～865 aa，蛋白質相對分子質量為79 490～96 330，理論等電點為5.19～8.97，53%的成員為酸性蛋白質；亞細胞定位預測結果顯示，除RsHAK2、RsHAK10、RsHAK11分布在液泡膜上外，其余RsHAK主要定位于質膜上（表2）。此外，RsHAK14和RsHAK15的編碼區長度和蛋白質序列長度完全一致，且位于2號染色體相鄰位置（圖1），來自于串聯復制事件。

2.2 蘿卜RsHAK系統進化、基因結構及保守基序分析

為研究蘿卜RsHAK的進化關系，選擇與擬南芥、水稻HAK/KUP/KT共同構建系統進化樹（圖2）。結果顯示，3個物種的HAK/KUP/KT可以聚為4個亞家族（Ⅰ～Ⅳ）；RsHAK主要分布在亞家族Ⅱ（6個）、亞家族Ⅲ（6個）、亞家族Ⅳ（4個），亞家族Ⅰ中僅含有RsHAK5。基因結構分析結果表明，RsHAK基因結構高度保守，除RsHAK5（9 434 bp）外，基因序列全長集中在3 030～4 497 bp，大部分含有7～10個外顯子（圖3）。其中，RsHAK16和RsHAK5含有較長的內含子，尤其是RsHAK5， 可能為更古老的基因。保守基序分析確定了10個Motif為蘿卜RsHAK蛋白重要保守基序，這些Motif在RsHAK蛋白中均有分布，可能對RsHAK蛋白功能起重要作用（圖3）。

2.3 蘿卜RsHAK基因家族的擴張

為確定蘿卜RsHAK基因的擴張模式，從蘿卜基因組數據庫中提取染色體位置信息（圖1）。RsHAK基因家族成員中16個位于染色體，1個位于Scaffold00840。蘿卜3號、7號和9號染色體各包含1個RsHAK基因；4號和8號染色體各有2個RsHAK基因；6號染色體有3個RsHAK基因；2號染色體包含6個RsHAK基因。RsHAK在2號染色體（RsHAK14和RsHAK15）、4號染色體（RsHAK13和RsHAK16）上各有１對發生過串聯復制的基因對，表明蘿卜RsHAK家族基因在進化過程中發生了少量的串聯重復現象。利用MCScanX軟件對蘿卜RsHAK基因進行擴張模式分析，結果顯示，蘿卜RsHAK基因有9個成員彼此間（11對）存在共線性關系（表3），表明蘿卜RsHAK基因家族在進化過程中發生了大量的基因復制現象，是蘿卜RsHAKs基因多樣性的主要驅動力。共線性基因對的Ka和Ks計算結果（表3）表明，所有基因對的Ka/Ks比值均lt;1.000 0，說明純化選擇在RsHAK基因擴張過程中起主要作用。利用公式T=Ks/2λ計算RsHAKs基因對重復事件的演化時間，結果表明，蘿卜RsHAK基因家族全基因組復制事件發生在5.55×106～10.90×106年前。

2.4 蘿卜RsHAK啟動子序列分析

基因的啟動子元件通過基因上游2 kb序列進行分析，利用PLACE數據庫（http：//www.dna.affrc.go.jp/PLACE）對17個RsHAK基因啟動子區域的順式作用元件進行鑒定和分類。共鑒定出154個長度大于4 bp的順式作用元件，RsHAK基因啟動子區域除存在大量基本啟動子元件CAAT-box外，大多數RsHAK基因的啟動子包含多種與生長發育及抗性相關的調控元件，如光響應、ABA（脫落酸）響應、MeJA（茉莉酸甲酯）響應、晝夜節律調節等涉及光周期、對植物激素響應及對環境壓力應答的調控元件（表4）。結果表明，蘿卜RsHAK基因不僅參與K+吸收代謝，還在植株生長發育和逆境脅迫響應過程中發揮重要作用。

2.5 蘿卜RsHAK家族基因表達模式及缺鉀/高鉀脅迫響應分析

基于轉錄組測序數據，以FPKM值代表基因表達量對蘿卜中RsHAK基因的表達水平進行分析，并以此繪制相對表達量熱圖（圖4）。結果表明，除RsHAK14和RsHAK15外，其他15個基因在蘿卜根、葉、花等器官及各發育階段中均有表達（圖4）。RsHAK1主要在蘿卜成熟葉（播種后第28 d）中表達，RsHAK2主要在雌蕊中表達，RsHAK3、RsHAK5、RsHAK10和RsHAK13主要在根中表達。說明，RsHAK家族成員在蘿卜生長發育過程中及不同組織中表達存在特異性，可能在多個發育階段發揮多種調控作用。

通過qRT-PCR進一步分析17個RsHAKs基因在K+缺失和K+高滲脅迫條件下的表達模式，結果（圖 5）顯示，RsHAK在缺K+和高K+脅迫下，地上部和地下部呈現出表達特異性。除RsHAK5僅在蘿卜根部組織中有表達外，其他RsHAKs基因在地上和地下部均有表達。RsHAK5在缺K+和高K+脅迫下在根部的相對表達量均出現下調，在缺K+環境中更為顯著。RsHAK1、RsHAK2、RsHAK4和RsHAK17主要在蘿卜葉片中表達，其中，RsHAK2、RsHAK4和RsHAK17呈顯著的高K+脅迫誘導型表達模式，其在葉片中的相對表達量在高K+脅迫處理下顯著上調；RsHAK3和RsHAK6～RsHAK16在蘿卜根和葉中均有較豐富的表達，RsHAK3、RsHAK6在缺K+和高K+處理下在葉中的相對表達量顯著上調，且對高K+脅迫的響應更顯著，而在根中的表達則受高K+脅迫抑制，僅在缺K+環境中上調表達；RsHAK9、RsHAK11、RsHAK12在缺K+環境中根部相對表達量顯著上調，而在高K+環境中葉部相對表達量顯著上調，RsHAK7、RsHAK8、RsHAK9、RsHAK14/RsHAK15在葉片中的相對表達量更易受高K+脅迫誘導。以上結果表明，不同RsHAK在蘿卜K+吸收轉運過程及抗逆作用中發揮的功能可能存在較大差異，具有不同的分工。

3 討論與結論

HAK/KUP/KT基因家族作為植物體內最大的K+轉運蛋白家族，在植物生長發育、營養代謝、抵御逆境等過程中發揮重要作用，迄今已在多種作物中被鑒定，但在蘿卜中尚未見報道。本研究中，我們從蘿卜全基因組數據中鑒定出17個RsHAK基因，蘿卜RsHAKs基因數量與擬南芥（13個）[22]、番茄（19個）[14]和桃（16個）[37]等相近，但低于水稻（27個）[7]、玉米（27個）[9]、大豆（29個）[10]、梨（27個）[16]等。將蘿卜RsHAK與擬南芥、水稻進行系統進化分析，結果顯示聚為4個亞家族；RsHAKs基因主要分布在亞家族Ⅱ中，與水稻[7]相似。亞家族I中的成員，如擬南芥中的AtHAK5[22]、水稻中的OsHAK1[7]等都被報道與根系高親和力K+吸收有關，該亞家族中的RsHAK5基因可能在蘿卜根系中對K+具有高親和力。亞家族Ⅱ中的成員被報道主要參與了植物發育過程[38]，本研究中RsHAK1～RsHAK3和RsHAK9～RsHAK11分布在亞家族Ⅱ中，可能在蘿卜生長發育過程中發揮重要作用。蘿卜RsHAK基因家族編碼的氨基酸為715～865 aa，蛋白質相對分子質量為79 490～96 330，理論等電點為5.19～8.97，基因序列長度、內含子/外顯子數目、保守基序類型及數量、跨膜結構域等存在高度保守性，也是蘿卜RsHAK呈現高度保守性的重要原因，這些結果為研究蘿卜RsHAK基因功能奠定了基礎。

前人研究結果表明，HAK/KUP/KT基因家族并不只是簡單地介導了土壤中初級K+的吸收，還參與了植株的生長發育、抗逆調控等過程。擬南芥AtKUP2突變被證明會導致胚軸變短[39]，敲除AtKT3會導致根部根毛增加[40]。K+轉運蛋白編碼基因還可能參與了鹽脅迫調控，如擬南芥中的AtHAK1、AtHAK2、AtHAK6 [41]等；部分水稻OsHAKs參與了激素調控，如OsHAK7、OsHAK8參與萘乙酸調控，OsHAK16參與赤霉素調控，OsHAK17、OsHAK27參與了萘乙酸、赤霉素和細胞分裂素代謝等[7]。本研究在RsHAKs基因上游啟動子序列中發現了一系列參與光周期和晝夜節律調節、植物激素反應、應答逆境脅迫等的順式作用元件。在這些調控元件中，光響應元件Box-4分布在鑒定出的17個RsHAK基因中，大多數RsHAK基因的啟動子區域還包含G-box和AE-box等與光周期和晝夜節律調節相關的順式作用元件。另外，啟動子區還包含：低溫響應元件（LTR）；植物激素響應元件TGACG（茉莉酸甲酯）、CGTCA（茉莉酸甲酯）、TGA（生長素）；干旱誘導響應元件MBS等。上述結果說明，RsHAKs在光周期、激素調節、低溫響應、抵抗干旱等方面起重要作用。

土壤溶液中的K+濃度通常在0.000 001%～0.000 200%[42]。因此，K+缺乏是植物必須面對的一種常見的非生物脅迫［43］，但由于近年來化肥的大量不合理施用，導致部分農耕地出現鹽漬化等問題。HAK/KUP/KT基因對K+的吸收利用及非生物脅迫響應均具有重要作用，本研究利用qRT-PCR分析了蘿卜幼苗在缺鉀和高鉀處理下的表達模式，以此篩選和鑒定可能在缺鉀和高鉀脅迫應答中發揮重要作用的RsHAK基因。結果表明，系統進化樹中唯一聚類在亞家族Ⅰ中的RsHAK5僅在蘿卜根中表達，且受到缺鉀和高鉀脅迫抑制；進一步驗證了HAK/KUP/KT基因家族亞家族Ⅰ中基因主要在根中表達，參與植物根系對環境中K+的吸收和運輸[22-23]。與AtKUP6、AtKUP8同源的RsHAK8、RsHAK9、RsHAK10在缺鉀脅迫下在根中的相對表達量上調，且在高鉀環境下葉片中的相對表達量顯著上調，擬南芥AtKUP6、AtKUP8已被驗證參與根部K+的流出[44]，推測RsHAK8、RsHAK9、RsHAK10可能參與蘿卜根部的K+轉運。RsHAK3與AtKUP3同源，而后者由K+饑餓強烈誘導[45]，RsHAK3在低鉀環境中葉片和根中的相對表達量均顯著上調，證實RsHAK3也存在K+饑餓誘導表達模式。序列相似的直系同源蛋白質通常具有相似的功能，本研究中RsHAKs基因表達模式與前人研究結果基本一致，說明HAK/KUP/KT基因家族在不同物種中具有高度保守性。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-08-11

基金項目：江蘇省農業科技自主創新基金項目[CX（21）2020]；江蘇省環洪澤湖生態農業生物技術重點實驗室自主研發課題（17HZHL015）；淮安市農業科學研究院橫向課題（0012021028H）

作者簡介：程 瑞（1991-），男，安徽潛山人，博士，助理研究員，從事園藝作物種質創新應用與遺傳育種研究。（Tel）18762046231；（E-mail）chengrui@jaas.ac.cn

通訊作者：趙建鋒，（E-mail）350043736@qq.com