牛LATS2基因啟動子克隆及轉錄調控分析

摘要： 本研究旨在探究牛LATS2基因組織表達規律，利用相對熒光素酶活性數值確定其啟動子核心區域并初步鑒定其核心區域關鍵轉錄因子，以闡明牛LATS2基因的轉錄調控機制。利用RT-qPCR檢測牛LATS2基因在心、脾、肝、腎、肺、背最長肌、皮下脂肪、皺胃、大腸及睪丸等中的相對表達量，構建LATS2蛋白進化樹?？寺ATS2基因5′端非翻譯區上游1.7 kb序列，利用逐段缺失引物，巢式擴增其7個啟動子區不同截斷體缺失片段（-1 792～+179、-1 475～+179、-1 098～+179、-727～+179、-515～+179、-248～+179和-56～+179），并將不同截斷體構建至雙熒光素酶報告載體pGL3-Basic上。重組的LATS2基因啟動子雙熒光素載體分別轉染小鼠成肌細胞（C2C12）和小鼠脂肪細胞（3T3-L1）細胞系，鑒定其啟動子核心區域。進一步借助在線軟件JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）和Genomatix（http：//www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector）分析啟動子核心區域序列特征，并預測關鍵轉錄因子結合位點。結果顯示，LATS2基因在肝和背最長肌中表達量極顯著高于脾（Plt;0.01）；LATS2蛋白構建的進化樹顯示反芻動物單獨聚為1支，表明LATS2基因在反芻動物進化過程中保守性較高；蛋白質互作分析篩選出的與LATS2蛋白互作緊密的前10種蛋白質均為Hippo信號通路中的關鍵蛋白質。LATS2基因啟動子核心區域位于-248～-56，預測其啟動子核心區域有與肌肉發育相關的轉錄因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、MyoG和Myod1的結合位點，表明LATS2基因在牛肌肉生長發育中扮演重要角色。以上結果為探究牛LATS2基因在肌肉生長發育中轉錄調控機制奠定基礎。

關鍵詞： 牛；LATS2基因；組織表達；啟動子；轉錄調控

中圖分類號： S823.8+1 文獻標識碼： A 文章編號： 1000-4440（2023）03-0753-09

Promoter cloning and transcriptional regulation of bovine LATS2 gene

ZHANG Jiu-pan1， SONG Ya-ping2， JIANG Chao2， WANG Jin1， WEI Da-wei2

（1.Institute of Animal Science， Ningxia Academy of Agricultural and Forestry Sciences， Yinchuan 750002， China;2.School of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract： The purpose of this study was to explore the tissue expression of bovine LATS2 gene， and identify its core promoter region and key transcription factors， so as to clarify the transcriptional regulation mechanism of bovine LATS2 gene. The relative expression levels of bovine LATS2 were detected in heart， spleen， liver， kidney， lung， longissimus dorsi muscle， subcutaneous fat， abomasum， large intestine and testis by RT-qPCR， and the evolutionary tree of LATS2 protein was constructed. The 1.7 kb sequence upstream of the 5′-untranslated region of LATS2 gene was cloned， and the promoter sequence regions of seven segments with -1 792-+179， -1 475-+179， -1 098-+179， -727-+179， -515-+179， -248-+179 and -56-+179 missing segments were amplified， and the dual-luciferase reporter vector pGL3-Basic was constructed respectively. The recombinant LATS2 gene promoter vectors were transfected into C2C12 and 3T3-L1 cell lines， respectively， and the core promoter regions were identified. With the help of online software Genomatix and JASPAR， the sequence characteristics of core promoter were analyzed to predict the binding sites of key transcription factors. The results showed that the expression of bovine LATS2 gene in liver and longissimus dorsi muscle was significantly higher than that in spleen （Plt;0.01）. Ruminants were clustered into one branch in the evolutionary tree constructed according to LATS2 protein， which indicated that LATS2 gene was highly conserved in the evolutionary process of ruminants. The top ten proteins closely interacting with LATS2 protein screened by protein interaction analysis were the key proteins in Hippo signaling pathway. The core region of the LATS2 gene promoter was located at -248--56. It was predicted that the core promoter region of bovine LATS2 gene had binding sites of transcription factors TEAD1， MEF2A， FOSL1， MyoG and Myod1 related to muscle development. It showed that LATS2 gene played an important role in the growth and development of bovine muscle. The above results lay a foundation for exploring the transcriptional regulation mechanism of bovine LATS2 gene in muscle growth and development.

Key words： cattle;LATS2 gene;tissue expression;promoter;transcriptional regulation

骨骼肌是動物軀體最重要的組成部分，其生長發育直接影響甚至決定家畜的產肉量，骨骼肌的生物學特性是衡量家畜潛在經濟性能的標準[1]，另外，骨骼肌是動物體動作和能量代謝的主要參與者，在機體的代謝平衡維持中起十分重要的作用[2]。骨骼肌發生發育過程極其復雜精細，從靜息肌衛星細胞的激活、成肌細胞的增殖分化，到肌纖維形成的終末階段[3-4]，全過程除了受遺傳、環境及營養水平調控外，更多取決于基因的控制[5]，且細胞信號分子、轉錄因子、非編碼RNA等諸多調節因子精準地參與其中復雜的網絡調控[6-11]。目前，為促進骨骼肌的生長發育以改善肉質從而實現肉牛的遺傳改良，基因的功能鑒定和篩選已成為一種熱門且有效的手段。

哺乳動物中調節細胞生長的Hippo信號通路十分保守，通過關鍵因子Salvador1（Sav1）、MST1/MST2、Yep等相關基因及大腫瘤抑制基因1/2（LATS1/LATS2）調控細胞的增殖、分化、凋亡以及干細胞的自我更新，從而實現對器官體積大小的控制[12-13]。LATS2基因作為Hippo信號通路的核心成員之一，與通路中的其他關鍵因子共同調控動物體器官的生長發育，主要表現在影響心臟肌肉的發育[14-15]。目前，關于LATS2基因功能研究主要集中在其參與腫瘤細胞發生及調控細胞增殖的機理方面[16-18]，但LATS2基因對動物體骨骼肌生長發育中的調控有重要作用且研究較少。王利宏等[19]、鮑建軍等［20］發現LATS2基因多態性與湖羊肌肉生長發育有顯著關聯，同時還發現YAP1基因在正常表型羊和雙肌臀羊中的表達存在差異，且LATS1/LATS2基因可與YAP1基因互作抑制肌肉生長發育［21］。

此外，我們前期研究發現LATS1基因在牛背最長肌等多個組織中高表達，且其核心啟動區結合了肌肉生長發育相關的Myod1和MEF2A轉錄因子并調控其轉錄活性，初步闡明了LATS1基因參與牛的肌肉生長發育轉錄調控機制[22]。LATS2基因與LATS1基因同屬LATS基因家族，其分子序列及結構相似，因此我們推測LATS2在牛肌肉生長發育中扮演重要角色，但其轉錄機制不清。鑒于此，本研究擬構建LATS2基因在牛不同肌肉組織或器官中的表達譜，克隆并鑒定其啟動子核心區域，預測LATS2基因啟動子核心區域的關鍵轉錄因子，以期為探究牛LATS2基因在肌肉生長發育過程中的轉錄調控機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

采集3頭20月齡秦川牛公牛的肝（右葉）、背最長肌、睪丸、肺（中葉）、腎（皮質）、皮下脂肪、心（心房）、皺胃（胃壁）、大腸（盲腸段）、脾（實質）和頸部靜脈血樣，迅速置于液氮帶回實驗室備用。

1.2 主要試劑

pMD-19T（Simple）載體、PrimeSTAR GXL Premix、基因組DNA提取試劑盒、DH5α感受態細胞、DNA凝膠回收試劑盒、限制性內切酶KpnⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶、RNA提取試劑盒、反轉錄及熒光定量試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司；去內毒質粒提取試劑盒購自Omega Bio-Tek公司；Dual-Luciferase雙熒光素酶報告系統購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；DMEM培養基、磷酸緩沖鹽溶液（PBS）、OPTI-MEM、Lipofectamine 3000 Reagent脂質體轉染試劑盒及胎牛血清（FBS）購自賽默飛世爾科技公司；雙熒光檢測試劑盒購自普洛麥格（北京）生物技術有限公司；pGL3-Basic及pRL-TK載體、小鼠成肌細胞（C2C12）和小鼠脂肪細胞（3T3-L1）為本實驗室保存。

1.3 RT-qPCR檢測

首先提取不同組織或器官總RNA，并按照反轉錄試劑盒說明書將各個RNA進行反轉錄，檢測cDNA質量。利用Primer 5.0軟件設計RT-qPCR引物，以GAPDH作為內參基因（引物見表1），使用7500 Fast Real Time儀器（美國應用生物系統公司產品）進行定量PCR。反應總體系為20.0 μl，其中上/下游引物各0.8 μl（引物濃度為10 μmol/L）、cDNA模板2.0 μl（模板質量濃度為50 ng/μl）、Primix Ex TaqⅡ 10.0 μl、ROX Reference DyeⅡ 0.4 μl，剩余用ddH2O補齊。RT-qPCR反應程序為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，循環40次，生物學重復3次，采用2-△△Ct法處理分析相對表達量數據[23]，數據采用SPSS 20.0軟件進行單因素差異性分析。

1.4 生物信息學分析

結合NCBI數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）及UCSC（https：//genome.ucsc.edu/）網站參考牛基因組信息，確定LATS2基因啟動子區域。利用Uniprot（https：//www.uniprot.org/）和MEGA 5.0（https：//www.megasoftware.net/index.php）構建出LATS2蛋白進化樹，使用ExcertSy ProtParm（https：//web.expasy.org/protparam/）在線程序進行蛋白質序列分析，使用String（http：//string-db.org/）預測與LATS2蛋白互作的蛋白質。

1.5 啟動子克隆及逐段缺失片段擴增

根據牛LATS2基因啟動子序列信息，設計其啟動子全長擴增引物LATS2-PF/PR（表1），引物長度為1 972 bp，包括-1 792～+179序列。以基因組DNA為模板，參考PrimeSTAR GXL Premix操作手冊進行PCR，總體系20.0 μl，其中，4.0 μl dNTP Mixture，10.0 μl 2×PrimeSTAR GXL Buffer，上/下游引物各0.8 μl（濃度為10 μmol/L），1.0 μl PrimeSTAR GXL DNA聚合酶，底物1.0 μl（質量濃度為50 ng/μl），2.4 μl ddH2O。PCR擴增程序使用3步法：98 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，68 ℃ 15 s，循環35次。PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，預期片段純化回收后與pMD-19T（Simple）載體連接，轉化后篩選陽性克隆進行測序鑒定。

根據測序結果，設計5′端逐段缺失片段的上游引物（F1～F7）和1條固定的下游引物（R），在引物5′端添加KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切位點（表1），以LATS2基因-1 792～+179序列為模板進行缺失片段的PCR擴增反應（擴增體系、程序同上），將擴增片段分別連接pMD-19T（Simple）載體進行測序鑒定。得到的逐段缺失片段分別命名為：LATS2-P1、LATS2-P2、LATS2-P3、LATS2-P4、LATS2-P5、LATS2-P6和LATS2-P7。

1.6 雙熒光素報告載體構建

使用內切酶KpnⅠ和XhoⅠ將LATS2-P1～LATS2-P7片段和pGL3-Basic載體在37 ℃條件下酶切1 h，酶切完成后進行目的片段純化回收。進一步將LATS2-P1～LATS2-P7片段分別和pGL3-Basic載體用T4 DNA連接酶（16 ℃條件下）連接1 h。將產物轉化至DH5α感受態細胞培養后篩選陽性克隆并鑒定，進一步使用去內毒質粒提取試劑盒提取質粒，備用。

1.7 細胞培養、轉染及測定酶活性

復蘇C2C12和3T3-L1，培養基為10%胎牛血清（FBS）+90% DMEM培養基，待其生長狀態良好且密度達到70%～80%后進行傳代培養。傳代生長后選擇形態良好的細胞進行24孔板鋪板，按照Lipofectamine 3000 Reagent脂質體轉染試劑盒說明書，分別將構建好的雙熒光素報告載體LATS2-pGL3-P1～LATS2-pGL3-P7 800 ng重組質粒和20 ng內參質粒pRL-TK共轉染至C2C12和3T3-L1，進行3次重復，陰性對照為pGL3-Basic質粒。在轉染48 h后進行細胞收集，利用雙熒光檢測試劑盒進行熒光素酶和海腎熒光素酶活性測定，計算二者的比值，確定LATS2基因的啟動子核心區域。

1.8 關鍵轉錄因子預測

通過JASPAR（http：//jaspar.genereg.net/）和Genomatix（http：//www.genomatix.de/cgi-bin//mat-inspector）在線軟件分析啟動子核心區域序列，預測閾值設置為90%以上，選取2個網站預測結果的共同部分，篩選LATS2基因的啟動子核心區域關鍵的轉錄因子結合位點。

1.9 數據分析

數據結果以平均值±標準差表示，數據顯著性檢驗使用SPSS 18.0 軟件進行單因素方差分析（Plt;0.01為差異極顯著； Plt;0.05為差異顯著）。

2 結果與分析

2.1 LATS2基因組織表達規律

RT-qPCR結果（圖1）顯示，LATS2基因在肝、背最長肌、睪丸、肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾中均檢測出表達信號，以脾中的表達量作為對照，該基因在肝和背最長肌中的表達極顯著地高于脾（Plt;0.01），其次在睪丸中高表達（Plt;0.05），在肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾中表達量較低。

2.2 牛LATS2基因的結構特征及進化樹構建

LATS2基因位于第12號染色體，全長51 096 bp，包括9個外顯子和8個內含子，共轉錄3 048 bp的mRNA序列，可編碼1 015個氨基酸（圖2），LATS2蛋白分子式為C4 882H7 628N1 418O1 425S35，其相對分子質量為110 110，等電點（pI）為8.84。

以LATS2蛋白序列為對象，利用MEGA 5.0軟件構建牛、綿羊、山羊、馬、豬、小鼠等物種的系統進化樹（圖3）。構建出的系統進化樹表明LATS2蛋白在牛、綿羊、山羊、馬、豬、小鼠等物種中進化較為保守，反芻動物在進化過程中單獨聚為1支，上述結果表明LATS2具有重要功能且在反芻動物進化過程中極度保守。

2.3 牛LATS2蛋白互作分析

使用String（http：//string-db.org/）預測與LATS2蛋白互作的蛋白質，得到圖4所示的蛋白質互作網絡。網絡中與LATS2蛋白互作緊密的前10種蛋白質分別為YAP1、MOB1A、MOB1B、SAV1、AMOTL2、WWC1、WWTR1、AMOT、AMOTL1、NF2，分析其信息，與KEGG收錄的Hippo信號通路成員及Biogrid收錄的與YAP1互作的蛋白質進行比對后，發現篩選出的上述蛋白質均為Hippo信號通路中的關鍵蛋白質。

2.4 LATS2基因啟動子核心區域鑒定

通過PCR擴增到牛LATS2基因啟動子1.7 kb序列，根據逐段缺失引物進行PCR擴增，獲得7個逐段缺失的LATS2基因啟動子片段（逐段缺失片段擴增電泳見圖5）。進一步連接pGL3-Basic載體，構建得到了逐段缺失重組質粒，將其命名為：pLATS2-1 792～+179、pLATS2-1 475～+179、pLATS2-1 098～+179、pLATS2-727～+179、pLATS2-515～+179、pLATS2-248～+179和pLATS2-56～+179。測序鑒定后，使用Lipofectamine 3000 Reagent脂質體分別將pGL3-Basic質粒和7個重組質粒轉染至3T3-L1和C2C12細胞系，檢測啟動子的活性。相對熒光素酶活性數值（圖6）顯示，LATS2基因啟動子區域的1.7 kb序列在C2C12和3T3-L1細胞系中均有較高的轉錄活性。當缺失-1 098～-727片段后，pLATS2-727～+179較pLATS2-1 098～+179酶活性在C2C12細胞系中顯著下降（Plt;0.05）；進一步缺失啟動子片段-248～-56，發現pLATS2-56～+179較pLATS2-248～+179酶活性在C2C12和3T3-L1細胞系中均極顯著下降（Plt;0.01），分別下降了79.4%和75.6%。上述研究結果表明，LATS2基因啟動子區域的1.7 kb序列活性較高，具備調控基因轉錄活性的功能；-248～-56為LATS2基因啟動子核心區域；LATS2基因在C2C12細胞系的轉錄活性高于3T3-L1。

2.5 啟動子核心區域的關鍵轉錄因子鑒定

利用Genomatix和JASPAR軟件對LATS2基因啟動子區和核心區域（-248～-56）進行分析并對潛在的關鍵轉錄因子進行預測，結果（圖7）顯示，LATS2基因啟動子核心區域包含轉錄增強因子TEF1（TEAD1）、肌肉細胞特異性增強因子2A（MEF2A）、FOS樣抗原1（FOSL1）、肌細胞生成素（Myog）和生肌決定因子（Myod1），初步推測轉錄因子TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1可能對LATS2基因的轉錄活性有重要的調控作用。

下劃線為引物序列，方框表示相對應的轉錄因子結合位點，箭頭指示轉錄起始位點。FEAD1：轉錄增強因子TEF1;MEF2A：肌肉細胞特異性增強因子2A；FOSL1：FOS樣抗原1；Myog：肌細胞生成素；Myod1：生肌決定因子。

3 討論

骨骼肌是動物軀體最重要的組成部分，占胴體質量的40%左右，其發育程度直接影響甚至決定家畜的產肉量，LATS2基因對細胞的增殖、凋亡以及骨骼肌的形成有重要的調控作用，而調控機制并不清楚。已有文獻報道，LATS1基因[21]、LATS2基因[19]與湖羊肌肉生長發育顯著相關。因此，本試驗開展了牛LATS2基因有關研究，成功克隆了牛LATS2基因啟動子，檢測了啟動子活性并鑒定到啟動子核心區域，預測到該基因啟動子核心區域中的重要轉錄因子，為探究牛LATS2基因在肌肉生長發育中的轉錄調控機制奠定基礎。

本研究中，牛LATS2基因在肝、背最長肌、睪丸、肺、腎、皮下脂肪、心、皺胃、大腸和脾等不同組織或器官中均有表達，在肝中的表達量最高，背最長肌其次，在心、肺、皮下脂肪、腎、皺胃、大腸和脾等組織或器官中相對表達量較低。上述研究結果表明LATS2基因在牛不同組織或器官中的相對表達量有差異，該基因的高表達可能影響肝以及肌肉組織的正常發育，這同LATS2基因表達量與湖羊肌肉生長發育顯著相關[19]的結果一致。系統進化樹結果顯示，LATS2基因在反芻動物進化過程中保守性較高；預測出的前10種互作蛋白質均為Hippo信號通路中重要的轉錄調控因子。Hippo通路的核心是一個激酶級聯反應，其中，SAV1和MOB1形成一種復合體并在細胞質中被磷酸化來調控LATS1/2表達，待LATS1/2被激活后，其激酶反過來去磷酸化并抑制轉錄共激活因子YAP和TAZ。去磷酸化的YAP/TAZ進入細胞核后與TEAD1-4等多種轉錄因子發生互作，從而抑制凋亡的基因表達并誘導細胞增殖[24-25]。研究發現LATS1/2和Mst1/2可通過KIBRA、NF2、RASSF等多種上游信號分子調控Hippo信號通路的活性，如AMOT等因子通過結合LATS1/2將YAP/TAZ等因子緊密連接在細胞質中，YAP/TAZ的磷酸化可進行細胞信號調控。YAP/TAZ和LATS1/2的穩定性可通過蛋白質泛素化進行調控[26]。綜上，LATS2基因在細胞信號轉導及細胞增殖分化中起重要作用。

通過啟動子逐段缺失載體活性檢測，發現牛LATS2基因啟動子核心區域位于-248～-56，進一步預測牛LATS2基因啟動子核心區域有TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1等轉錄因子結合位點。研究結果表明，TEAD1可調控肌肉特異性基因TNNT2、Mhc、α-actin[27]和COL1A1[28]的表達，在心肌、骨骼肌、平滑肌的發育方面有至關重要的調控作用[27-29]。TEAD1蛋白還可以與Hippo信號通路中YAP蛋白形成蛋白質復合物，從而抑制細胞增殖、促進細胞凋亡[30]。MEF2A作為肌肉發生的重要核心因子，對骨骼肌和心肌細胞的增殖和分化有重要調控作用[31]，同時能夠促進生長因子、肌球蛋白重鏈及膠原對損傷骨骼肌的修復[32]；該因子能夠特異性識別并結合大多數肌肉基因啟動子中的A/T序列，從而增強相關基因的表達[33]。FOSL1是轉錄因子AP-1復合體的組分之一，參與細胞的增殖和分化，抑制細胞凋亡，可介導Kras通路調控細胞周期蛋白質，誘導骨骼的發育[34]。Myog和Myod1作為調控肌肉細胞增殖、分化及肌纖維形成的關鍵基因[35]，突變會顯著影響肌肉纖維和肉質特性[36]。其中，Myod1對發育初級階段肌肉的可塑性和再生起關鍵作用[35]，當Myod1與PAX7共表達時，可激活基底膜靜息的肌肉衛星細胞使其增殖[37]；Myog通過調節肌肉肌酸激酶影響骨骼肌的發生發育[38]，研究結果表明，敲除小鼠Myog基因后骨骼肌發育受損，出生后肌肉會出現萎縮現象[39]。以上研究結果表明，TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1轉錄因子在個體生長發育以及肌肉形成過程中起重要作用，結合本研究關于轉錄因子結合位點的預測，我們可以推斷出上述5種轉錄因子對LATS2基因的轉錄可能起重要調控作用。但對于這一推斷將來還需要結合定點突變、凝膠遷移（EMSA）、染色質免疫共沉淀（ChIP）等技術手段進行深入研究。

4 結論

牛LATS2基因啟動子核心區域位于-248～-56，啟動子核心區域預測到TEAD1、MEF2A、FOSL1、Myog和Myod1轉錄因子結合位點。LATS2基因的組織表達規律、啟動子核心區域的轉錄因子結合位點預測及LATS2蛋白互作分析結果均表明LATS2基因在牛肌肉生長發育中扮演重要角色。以上結果為探究牛LATS2基因在肌肉生長發育中的轉錄調控機制奠定基礎。

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（責任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-06-15

基金項目：寧夏自然科學基金項目（2021AAC05007）；寧夏重點研發計劃項目（2020BEB04011）；寧夏青年科技人才托舉工程項目（TJGC2019076）

作者簡介：張久盤（1985-），女，河南商丘人，碩士，助理研究員，研究方向為動物遺傳育種。（E-mail）zhangjiupan@163.com

通訊作者：魏大為，（E-mail）weidaweiwdw@163.com