基于基因組預(yù)測(cè)和分析甘薯間座殼菌（Diaporthe batatas）分泌蛋白中效應(yīng)因子

摘要： 甘薯間座殼菌（Diaporthe batatas）是引起甘薯基腐病的病原菌之一，近年來(lái)在中國(guó)東南沿海發(fā)生較為普遍。由于效應(yīng)因子在致病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，本研究采用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息學(xué)軟件，對(duì)甘薯間座殼菌效應(yīng)因子進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。結(jié)果表明，從D. batatas全基因組編碼的13 864個(gè)蛋白質(zhì)中篩選到359個(gè)候選效應(yīng)因子，其中248個(gè)為質(zhì)外體效應(yīng)因子，68個(gè)為胞內(nèi)效應(yīng)因子，43個(gè)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子。在信號(hào)肽分析中，所有候選效應(yīng)因子信號(hào)肽長(zhǎng)度為14～37個(gè)氨基酸，在信號(hào)肽切割位點(diǎn)-3位到+2位出現(xiàn)頻率最高的氨基酸分別為丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、丙氨酸、脯氨酸。利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個(gè)軟件對(duì)359個(gè)候選效應(yīng)因子進(jìn)行碳水化合物活性酶（CAZyme）類(lèi)分析，結(jié)果表明，有89個(gè)蛋白質(zhì)屬于CAZyme，其中糖苷水解酶類(lèi)最多。eggNOG-mapper分析結(jié)果顯示，在359個(gè)候選效應(yīng)因子中有227個(gè)具有功能注釋?zhuān)饕婕疤妓衔镛D(zhuǎn)運(yùn)和代謝，翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、分子伴侶等生理過(guò)程。通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)9個(gè)候選效應(yīng)因子基因在D. batatas侵染過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)候選效應(yīng)因子基因在侵染過(guò)程中顯著上調(diào)，有2個(gè)沒(méi)有顯著變化。這些結(jié)果的獲得為明確甘薯間座殼菌效應(yīng)因子的功能，分析甘薯基腐病發(fā)病機(jī)理，篩選寄主抗性基因及研發(fā)特異性靶向農(nóng)藥提供了參考。

關(guān)鍵詞： 甘薯間座殼菌；分泌蛋白；效應(yīng)因子；基因功能分析；實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

中圖分類(lèi)號(hào)： S531 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2023）03-0665-09

Genome-wide prediction and analysis of the effector protein of Diaporthe batatas

TANG Wei1， ZHANG Cheng-ling1， MA Ju-kui1， YANG Dong-jing1， CHEN Jing-wei1， GAO Fang-yuan1，XIE Yi-ping1， WANG Fang2， SUN Hou-jun1

（1.Xuzhou Institute of Agricultural Sciences in Xuhuai Area/Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Sweetpotato of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xuzhou 221131， China;2.Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315100， China）

Abstract： Diaporthe batatas is one of pathogens causing sweet potato foot rot disease， which is common in the southeast coastal areas of China in recent years. As the effectors played an important role in the pathogenesis， SignalP 5.0， GPI-SOM， WoLF PSORT， TMHMM-2.0， EffectorP 3.0 and other bioinformatic softwares were used to predict and analyze the effectors of D. batatas. The results showed that a total of 359 candidate effectors were screened from the 13 864 proteins in the whole genome of D. batatas. Among these effectors， 248 effectors were apoplastic effectors， 68 effectors were cytoplasmic effectors and 43 effectors were dual-localized （apoplastic/cytoplasmic）. The result of signal peptides analysis showed that the lengths of signal peptides were 14-37 amino acids， and the amino acids with the highest frequency at the position -3-+2 of signal peptides cleavage site were alanine， serine， alanine， alanine， proline， respectively. The 89 candidate effectors were predicted and analyzed to be the carbohydrate-active enzyme （CAZyme） through the HMMER， DIAMOND and eCAMI softwares， and most of them belonged to glycoside hydrolase （GH）. A total of 227 candidate effectors were functionally annotated among the 359 candidate effectors using eggNOG-mapper， mainly involving carbohydrate transport and metabolism， posttranslational modification， protein turnover， chaperones and other physiological and biochemical processes. The relative expression levels of nine effectors were tested by qRT-PCR. The results showed that seven of them significantly increased at different infection stages， while two of them showed no significant change. These results provide a reference for clarifying the function of the effector， analyzing the pathogenesis of sweet potato foot rot disease， screening new resistant gene and developing specific targeted pesticides.

Key words： Diaporthe batatas;secreted protein;effector;gene functional analysis;quantitative real-time PCR （qRT-PCR）

甘薯間座殼菌（Diaporthe batatas）屬于子囊殼菌綱（Ascomycota）間座殼目（Diaporthales）間座殼科（Diaporthaceae），其無(wú)性態(tài)為擬莖點(diǎn)霉屬（Phomopsis）真菌[1]，是近年來(lái)在中國(guó)東南沿海薯田新發(fā)甘薯基腐病的病原菌之一[2-3]，也可導(dǎo)致甘薯干腐病、甘薯蔓枯病等[4-5]。甘薯發(fā)病后莖基部產(chǎn)生褐色病斑，然后逐漸擴(kuò)展，莖基部腐爛，導(dǎo)致甘薯莖上部枯萎。甘薯基腐病于1916年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)[6]。而中國(guó)于1998年在臺(tái)灣地區(qū)首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)該病[7]。近年來(lái)，D. batatas在中國(guó)東南沿海及日本、韓國(guó)均有報(bào)道[2，8-9]，具有向內(nèi)陸擴(kuò)展的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響中國(guó)東南沿海甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

不同的病原菌采用不同的方式侵染寄主植物，但相同的是病原菌會(huì)將效應(yīng)因子傳遞到寄主中，通過(guò)抑制植物防御反應(yīng)或改變植物生理機(jī)能從而完成病原菌對(duì)寄主侵染[10]。從狹義上講，植物病原真菌中的效應(yīng)因子是病原體分泌到寄主植物細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)[11]；從廣義上講則是改變宿主細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能并能夠促進(jìn)病原體定殖的蛋白質(zhì)與小分子[12]。根據(jù)亞細(xì)胞定位，真菌效應(yīng)因子可分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是在細(xì)胞外空間發(fā)揮作用的質(zhì)外體效應(yīng)子，另一類(lèi)是在宿主細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用的胞內(nèi)效應(yīng)子[13]。

盡管由于病原菌的分化和寄主的選擇性，效應(yīng)因子彼此之間不具有明顯的序列相似性，但研究發(fā)現(xiàn)效應(yīng)因子可以通過(guò)經(jīng)典的分泌途徑即內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜途徑侵入寄主。此類(lèi)效應(yīng)因子具有分泌蛋白的典型特征，即，具有N-端信號(hào)肽；不含糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定位點(diǎn)；亞細(xì)胞定位為分泌型；不含有跨膜結(jié)構(gòu)域[14-16]。

隨著越來(lái)越多真菌基因組測(cè)序的完成以及生物信息學(xué)的飛速發(fā)展［17-18］，利用生物信息學(xué)從病原菌基因組中對(duì)其編碼蛋白質(zhì)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)，篩選出其中的分泌蛋白以及效應(yīng)因子成為尋找病原菌致病基因的一種快速有效的方法，對(duì)研究真菌致病機(jī)制具有重要的指導(dǎo)意義。近年來(lái)，多種病原真菌的效應(yīng)因子已通過(guò)生物信息學(xué)的方法被預(yù)測(cè)分析，如何艷秋等[19]分析了尖孢鐮刀菌古巴專(zhuān)化型1號(hào)小種（Foc1）基因組及蛋白質(zhì)，篩選到988個(gè)經(jīng)典分泌蛋白及378個(gè)候選效應(yīng)因子；范春霞等[20]利用甜瓜粉霉病病原菌粉紅單端孢（Trichothecium roseum）基因組進(jìn)行了效應(yīng)因子的分析和預(yù)測(cè)，篩選到154個(gè)候選效應(yīng)因子。

甘薯間座殼菌作為甘薯新發(fā)病原，其基因組測(cè)序已完成，為預(yù)測(cè)效應(yīng)因子提供了數(shù)據(jù)支撐[21]。本研究擬利用SignalP 5.0、GPI-SOM、WoLF PSORT、TMHMM-2.0和EffectorP 3.0等生物信息學(xué)軟件，對(duì)D. batatas分泌蛋白的效應(yīng)因子進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析，并通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)9個(gè)候選效應(yīng)因子在病原菌侵染過(guò)程中的表達(dá)水平，以期為甘薯間座殼菌侵染機(jī)制的研究和效應(yīng)因子的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 D. batatas基因組編碼的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)

D. batatas全基因組編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#！/proteins/104620/1662410%￣7￣C￣D￣i￣a￣p￣o￣rthe%20batatas/Un/）下載獲取，共計(jì)13 864個(gè)蛋白質(zhì)氨基酸序列。

1.2 D. batatas經(jīng)典分泌蛋白中效應(yīng)因子的預(yù)測(cè)分析

1.2.1 甘薯間座殼菌全基因組蛋白質(zhì)N-端信號(hào)肽的預(yù)測(cè) 利用SignalP 5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0，設(shè)置參數(shù)Organism group，選擇Eukarya）對(duì)D. batatas 中13 864個(gè)基因組蛋白質(zhì)氨基酸序列進(jìn)行N-端信號(hào)肽預(yù)測(cè)[22]。篩選得到具有N-端信號(hào)肽的蛋白質(zhì)進(jìn)行下一步分析。

1.2.2 GPI錨定位點(diǎn) 對(duì)篩選獲得的含有信號(hào)肽的蛋白質(zhì)，利用GPI-SOM（http：//gpi.unibe.ch/）進(jìn)行GPI錨定位點(diǎn)的分析[23]，篩除含有GPI錨定位點(diǎn)的蛋白質(zhì)。

1.2.3 亞細(xì)胞定位分析 對(duì)含有N-端信號(hào)肽，不含有GPI錨定位點(diǎn)的蛋白質(zhì)通過(guò)WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/，設(shè)置參數(shù)Organism type，選擇Fungi）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析[24]，篩選出分泌到胞外的蛋白質(zhì)。

1.2.4 跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè) 對(duì)上述篩選到的分泌到胞外的蛋白質(zhì)利用TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）進(jìn)行分析[25]，篩選出不含有跨膜結(jié)構(gòu)域或僅有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域且在信號(hào)肽序列中的蛋白質(zhì)。

1.2.5 效應(yīng)因子預(yù)測(cè) 對(duì)上述篩選出的分泌蛋白利用EffectorP 3.0（http：//effectorp.csiro.au/）進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)出效應(yīng)因子[26]。利用eggNOG-mapper（http：//eggnog-mapper.embl.de/）對(duì)篩選出的效應(yīng)因子進(jìn)行功能分析[27]。

D. batatas候選效應(yīng)因子預(yù)測(cè)流程見(jiàn)圖1。

1.2.6 候選效應(yīng)因子信號(hào)肽特征分析 通過(guò)SignalP 5.0確定候選效應(yīng)因子信號(hào)肽位置，統(tǒng)計(jì)信號(hào)肽長(zhǎng)度以及信號(hào)肽切割位點(diǎn)氨基酸的出現(xiàn)頻率。

1.2.7 候選效應(yīng)因子碳水化合物活性酶類(lèi)預(yù)測(cè)和功能注釋 利用碳水化合物活性酶類(lèi)自動(dòng)注釋服務(wù)器dbCAN2（https：//bcb.unl.edu/dbCAN2/）中的HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個(gè)軟件對(duì)篩選出的甘薯間座殼菌候選效應(yīng)因子中的碳水化合物活性酶（CAZymes）類(lèi)進(jìn)行預(yù)測(cè)和功能注釋[28]。

1.3 D. batatas候選效應(yīng)因子的qRT-PCR分析

1.3.1 樣品接種 將煙薯25的甘薯藤蔓去掉葉片，用75%乙醇進(jìn)行表面消毒，用滅菌的刀片在莖稈上，切出長(zhǎng)度約1 cm 的條形傷口。將D. batatas的分生孢子懸液接種至傷口處，置于25 ℃ 8 h光照16 h黑暗交替的光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。在接種1 d和7 d時(shí)分別在接種處進(jìn)行取樣，樣品迅速置于液氮中，并置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)和RNA提取 選取9個(gè)候選效應(yīng)因子，依據(jù)其mRNA序列設(shè)計(jì)引物（表1）。利用多糖多酚RNA提取試劑盒，提取菌絲和接種樣品的RNA，置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 qRT-PCR分析 將提取的RNA利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物全部稀釋5倍后按照采用ABclonal 2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix使用說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為2×Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 7.5 μl、H2O 5.9 μl、上下游引物各0.3 μl、cDNA 1.0 μl，總計(jì)15.0 μl。將反應(yīng)體系置于熒光定量PCR儀中，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min， 40個(gè)循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)水平，利用SPSS 25進(jìn)行顯著性水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N-端信號(hào)肽分析

利用SignalP 5.0對(duì)D. batatas 中13 864個(gè)基因組蛋白質(zhì)序列進(jìn)行N-端信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，有1 625個(gè)蛋白質(zhì)序列含有N-端信號(hào)肽序列，占所有蛋白質(zhì)序列的11.72%。

2.2 GPI錨定分析

采用GPI-SOM軟件對(duì)含有N-端信號(hào)肽的1 625個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有298個(gè)蛋白質(zhì)序列含有GPI錨定位點(diǎn)，剩余1 327個(gè)蛋白質(zhì)不含有GPI錨定位點(diǎn)。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

采用WoLF PSORT對(duì)上述1 327個(gè)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，有1 154個(gè)蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)分泌至胞外，其余173個(gè)蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)定位到質(zhì)膜或其他細(xì)胞器中，其中74個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)膜，28個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到過(guò)氧化物酶體，28個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體，24個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)，15個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核，4個(gè)蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

2.4 跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)上述1 154個(gè)蛋白質(zhì)序列通過(guò)TMHMM-2.0進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有976個(gè)蛋白質(zhì)不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，152個(gè)蛋白質(zhì)含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，26個(gè)蛋白質(zhì)含有2個(gè)及以上的跨膜結(jié)構(gòu)域。在152個(gè)僅含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)中，有80個(gè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域與N-端信號(hào)肽區(qū)域重疊，所以這些蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域可能為前期所預(yù)測(cè)的信號(hào)肽區(qū)域。因此，1 056個(gè)蛋白質(zhì)（包含976個(gè)無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)和80個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與N-端信號(hào)肽區(qū)域重疊的蛋白質(zhì)）具有典型分泌蛋白特征，可用于下一步效應(yīng)因子的分析。

2.5 效應(yīng)因子預(yù)測(cè)分析

采用EffectorP 3.0對(duì)1 056個(gè)具有典型分泌蛋白特征的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，有359個(gè)蛋白質(zhì)被預(yù)測(cè)為效應(yīng)因子，占分泌蛋白總數(shù)的34.00%，其中68個(gè)蛋白質(zhì)為胞內(nèi)效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的18.94%；248個(gè)蛋白質(zhì)為質(zhì)外體效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的69.08%；43個(gè)蛋白質(zhì)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子也可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子，占所有候選效應(yīng)因子的11.98%（圖2）。

2.6 效應(yīng)因子信號(hào)肽特征分析

對(duì)359個(gè)候選效應(yīng)因子信號(hào)肽長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，其信號(hào)肽長(zhǎng)度最大為37個(gè)氨基酸，最小為14個(gè)氨基酸。信號(hào)肽長(zhǎng)度主要集中在16～22個(gè)氨基酸的范圍中，其中長(zhǎng)度為18個(gè)氨基酸的信號(hào)肽最多（70個(gè)），占候選效應(yīng)因子總數(shù)的19.50%；其次是長(zhǎng)度為19個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（68個(gè)），占候選效應(yīng)因子總數(shù)的18.94%（圖3）。

對(duì)效應(yīng)因子信號(hào)肽切割位點(diǎn)-3位到+2位氨基酸種類(lèi)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，在-3位，出現(xiàn)了丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸8種氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占54.32%；在-2位出現(xiàn)了除色氨酸外的所有氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是絲氨酸，占17.27%；在-1位出現(xiàn)了丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸8種氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占80.22%；在+1位出現(xiàn)了除脯氨酸外的所有氨基酸，其中出現(xiàn)最多的是丙氨酸，占24.51%；在+2位所有氨基酸均有出現(xiàn)，其中出現(xiàn)最多的是脯氨酸，占34.26%。由此可見(jiàn)-3位和-1位氨基酸相對(duì)保守，其中氨基酸組成為AXA型的占43.73%，可被SpaseI型信號(hào)肽酶識(shí)別。

2.7 效應(yīng)因子功能預(yù)測(cè)

經(jīng)eggNOG-mapper分析，在359個(gè)候選效應(yīng)因子中有227個(gè)可以注釋到具體功能，其中146個(gè)蛋白質(zhì)在COG分類(lèi)中分屬于A（RNA加工和修飾）、E（氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）、G（糖類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）、M（細(xì)胞壁、質(zhì)膜、包膜生物建成）、O（翻譯后蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶蛋白）、Q（次生代謝物生物合成、運(yùn)輸和分解代謝）、S（功能未知）、U（胞內(nèi)運(yùn)輸、分泌和囊泡運(yùn)輸） 8類(lèi)（圖4），其中G類(lèi)最多，有61個(gè)蛋白質(zhì)，包含57個(gè)質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個(gè)胞內(nèi)效應(yīng)因子和3個(gè)2類(lèi)效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子；其次是S類(lèi)，有59個(gè)蛋白質(zhì)，包含49個(gè)質(zhì)外體效應(yīng)因子，7個(gè)胞內(nèi)效應(yīng)因子和3個(gè)2類(lèi)效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子；O類(lèi)有20個(gè)蛋白質(zhì)，包含16個(gè)質(zhì)外體效應(yīng)因子，4個(gè)胞內(nèi)效應(yīng)因子；其余類(lèi)型蛋白質(zhì)中 A類(lèi)、E類(lèi)、M類(lèi)均包含1個(gè)為質(zhì)外體效應(yīng)因子，Q類(lèi)包含2個(gè)蛋白質(zhì)，分別是質(zhì)外體效應(yīng)因子和2類(lèi)效應(yīng)因子均可的效應(yīng)因子，U類(lèi)僅有1個(gè)蛋白質(zhì)，為胞內(nèi)效應(yīng)因子。

利用HMMER、DIAMOND和eCAMI 3個(gè)軟件對(duì)359個(gè)候選效應(yīng)因子進(jìn)行注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)有89個(gè)蛋白質(zhì)屬于CAZyme類(lèi)，分屬于糖苷水解酶 （GH）、糖基轉(zhuǎn)移酶（GT）、多糖裂解酶 （PL）、碳水化合物酯酶 （CE）、輔助活性酶（AA）和碳水化合物結(jié)合模塊 （CBM），占所有候選效應(yīng)因子的24.79%。其中HMMER預(yù)測(cè)到85個(gè)蛋白質(zhì)，DIAMOND預(yù)測(cè)到39個(gè)蛋白質(zhì)，eCAMI預(yù)測(cè)到70個(gè)蛋白質(zhì)，3種軟件均預(yù)測(cè)到的蛋白質(zhì)有32個(gè)（圖5）。在預(yù)測(cè)到的CAZyme類(lèi)中GH有36個(gè)，占40.45%；AA有21個(gè)，占23.60%；CE有14個(gè)，占15.73%；PL有13個(gè)，占14.61%；GT有1個(gè)，占1.12%；CBM有4個(gè)（表2），占4.49%。在預(yù)測(cè)到的36個(gè)GH中，包含了GH7、GH11、GH16、GH18、GH28等家族，可以歸到GH-A、GH-B、GH-C、GH-F、GH-K、GH-N 6類(lèi)（表2）。在不同類(lèi)型酶類(lèi)中，AA類(lèi)中AA9家族最多，有15個(gè)，其主要為裂解多糖或纖維素的單氧酶；CE類(lèi)中CE5家族最多，有5個(gè)，其主要是乙酰木聚糖酯酶或角質(zhì)酶；GH類(lèi)中GH28家族最多，有10個(gè)，其存在平行的β螺旋結(jié)構(gòu)，具有多聚半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸水解酶等功能；PL類(lèi)中PL3-2家族最多，有9個(gè)，其功能主要為果膠/果膠酸裂解。

在預(yù)測(cè)到的CAZyme類(lèi)中，AA中有20個(gè)是質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個(gè)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子；CE和CBM中均為質(zhì)外體效應(yīng)因子；GH中有35個(gè)是質(zhì)外體效應(yīng)因子，1個(gè)是胞內(nèi)效應(yīng)因子；PL中有10個(gè)是質(zhì)外體效應(yīng)因子，3個(gè)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子又可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子；GT中僅包含1個(gè)胞內(nèi)效應(yīng)因子（圖6）。

2.8 候選效應(yīng)因子qRT-PCR分析

qRT-PCR結(jié)果（圖7）顯示，甘薯間座殼菌侵染甘薯1 d時(shí)，候選的質(zhì)外體效應(yīng)因子基因均上調(diào)表達(dá)，其中基因Db8159084表達(dá)水平最高，是侵染0 d時(shí)的1.9倍，除基因Db8160770外，其他基因的表達(dá)量與侵染0 d相比均差異顯著（Plt;0.05），而侵染7 d時(shí)這些候選質(zhì)外體效應(yīng)因子基因中，除基因Db8160770的表達(dá)量與侵染0 d時(shí)基本一致外，其余基因仍上調(diào)表達(dá)但表達(dá)量較侵染1 d時(shí)有所下降，且僅有基因Db8168842的表達(dá)量與侵染0 d時(shí)相比具有顯著性差異。候選的胞內(nèi)效應(yīng)因子基因中，基因Db8163505在侵染0 d、1 d、7 d時(shí)的表達(dá)量無(wú)顯著差異，基因Db8160366和Db8168932的表達(dá)量均是在侵染1 d時(shí)顯著上調(diào)，侵染7 d時(shí)基因表達(dá)量較侵染0 d時(shí)差異不大。2個(gè)既可能是質(zhì)外體效應(yīng)因子也可能是胞內(nèi)效應(yīng)因子的基因在侵染1 d時(shí)和7 d時(shí)均顯著上調(diào)表達(dá)，侵染7 d時(shí)基因Db8165499的表達(dá)量顯著高于侵染1 d時(shí)的表達(dá)量；而侵染7 d時(shí)基因Db8168404 的表達(dá)量低于侵染1 d時(shí)的表達(dá)量。

3 討論

效應(yīng)因子是植物病原真菌重要的毒力因子，在病原菌侵染寄主過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，編碼效應(yīng)因子的基因稱(chēng)為Avr基因，寄主中與之對(duì)應(yīng)的抗性基因稱(chēng)為R基因。對(duì)病原真菌效應(yīng)因子的預(yù)測(cè)很大程度上依賴(lài)于生物信息學(xué)軟件[29]。近年來(lái)，病原菌侵染寄主的機(jī)制研究不斷深入，隨著病原真菌全基因組序列的不斷測(cè)定，以及生物信息學(xué)軟件、數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷涌現(xiàn)和在線化發(fā)展[30]，使通過(guò)生物信息學(xué)研究病原菌并預(yù)測(cè)效應(yīng)因子成為分析病原菌侵染機(jī)制較為便易的方法，在植物病原菌致病機(jī)制探索上進(jìn)行了廣泛應(yīng)用，如董章勇等[31]從茄子枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. melongenae）16 485個(gè)蛋白質(zhì)序列中篩選到29個(gè)候選致病效應(yīng)因子，Zhao等[32]分析了17 976個(gè)小麥葉銹病菌（Puccinia triticina）蛋白質(zhì)，篩選到904個(gè)具有保守基序的效應(yīng)因子并鑒定了PTTG_08198基因具有加速細(xì)胞凋亡進(jìn)程并促進(jìn)活性氧（ROS）積累的作用。

本研究從13 864個(gè)甘薯間座殼菌基因組蛋白質(zhì)中預(yù)測(cè)到359個(gè)效應(yīng)因子，占全基因組蛋白質(zhì)的2.59%，其中質(zhì)外體效應(yīng)因子最多，占預(yù)測(cè)到的候選效應(yīng)因子的69.08%。候選效應(yīng)因子信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)主要為AXA，屬于SpaseI型，這與范春霞等[18]對(duì)甜瓜粉霉病菌（Trichothecium roseum）的研究結(jié)果以及連小雨等[33]對(duì)向日葵柄銹菌（Puccinia helianthin Schw）的研究結(jié)果一致。

CAZyme不僅參與真菌自身的生長(zhǎng)代謝過(guò)程，其中部分酶類(lèi)還直接參與病原真菌和寄主的互作，如GH、PL和CE等酶類(lèi)是已知細(xì)胞壁降解酶，參與對(duì)細(xì)胞壁組分的降解過(guò)程[34]。從CAZyme活性分析來(lái)看，有89個(gè)具有活性的候選效應(yīng)因子， 其中在AA和GH類(lèi)型酶類(lèi)中，最多的分別是AA9和GH28，這2個(gè)家族的酶類(lèi)與細(xì)胞壁降解過(guò)程相關(guān)[35 ]，并在侵染豆科植物的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）[36]和侵染小麥的黑曲霉（Aspergillus niger）中均上調(diào)表達(dá)[37]，一般而言，GH28等果膠降解家族酶類(lèi)表達(dá)上調(diào)可能在發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮作用[36]，因此在甘薯間座殼菌中這2類(lèi)酶也可能在侵染過(guò)程中具有重要作用。在效應(yīng)因子類(lèi)型上看，CAZyme主要為質(zhì)外體效應(yīng)因子，這與部分質(zhì)外體效應(yīng)因子降解細(xì)胞壁功能作用部位相關(guān)，而胞內(nèi)效應(yīng)因子僅有2個(gè)，分別參與糖苷水解和糖基轉(zhuǎn)移。

本研究中預(yù)測(cè)獲得的效應(yīng)因子以假定蛋白質(zhì)為主，這與范春霞等[20]對(duì)甜瓜粉霉菌（T. roseum）效應(yīng)因子的預(yù)測(cè)結(jié)果一致。通過(guò)eggNOG-mapper有功能注釋的候選效應(yīng)因子有227個(gè)，可按照COG分為A、E、G、M、O、Q、S、U 8類(lèi)，以G類(lèi)最多。質(zhì)外體效應(yīng)因子主要為G類(lèi)和S類(lèi)，胞內(nèi)效應(yīng)因子主要為O類(lèi)和S類(lèi)。在S類(lèi)中部分候選效應(yīng)因子被注釋為與致死或毒素相關(guān)，如誘導(dǎo)壞死蛋白、蓖麻毒素-b鏈凝集素、CRISP家族蛋白質(zhì)等，盡管這類(lèi)蛋白質(zhì)在甘薯間座殼菌侵染寄主過(guò)程中的功能并不清楚，但這為下一步挖掘甘薯間座殼菌致病基因并解析其功能提供了參考。

在侵染過(guò)程中，所測(cè)的大部分候選效應(yīng)因子基因在侵染過(guò)程中上調(diào)表達(dá)，這與在其他病原菌如甜瓜粉霉菌[20]、向日葵柄銹菌[33]中預(yù)測(cè)的效應(yīng)因子類(lèi)似。在不同類(lèi)型效應(yīng)因子中，候選質(zhì)外體效應(yīng)因子和質(zhì)外體/胞內(nèi)效應(yīng)因子在侵染過(guò)程中表達(dá)上調(diào)且表達(dá)水平較高，而胞內(nèi)效應(yīng)因子表達(dá)上調(diào)但表達(dá)水平較低。從時(shí)間上看，大部分基因在甘薯間座殼菌侵染1 d時(shí)表達(dá)上調(diào)水平較高，7 d時(shí)有所下降，說(shuō)明這些基因在侵染前期發(fā)揮重要的作用。Db8165499基因表達(dá)量隨時(shí)間的推移而升高，經(jīng)eggNOG-mapper分析，Db8165499被注釋為多糖裂解酶家族3蛋白，經(jīng)CAZyme分析該蛋白質(zhì)是一種果膠酸裂解酶，可能在侵染過(guò)程降解甘薯細(xì)胞壁中發(fā)揮作用。qRT-PCR結(jié)果表明，盡管大部分預(yù)測(cè)的效應(yīng)因子在侵染過(guò)程中有顯著上調(diào)，但仍有部分預(yù)測(cè)的效應(yīng)因子在侵染過(guò)程中表達(dá)水平變化不大，一種可能是其在病原菌侵染的其他階段發(fā)揮作用，另一種可能是其并非該病原菌的效應(yīng)因子。

此外，盡管在研究中也發(fā)現(xiàn)通過(guò)囊泡或非囊泡運(yùn)輸?shù)绕渌緩椒置诘男?yīng)因子具有重要作用，如大麗輪枝菌（Verticillium dahliae）中的VdIsc1蛋白和玉蜀黍黑粉菌（Ustilago maydis）中的Cts1蛋白均通過(guò)非常規(guī)分泌途徑在侵染中發(fā)揮作用[38-39]。然而由于此類(lèi)效應(yīng)因子的復(fù)雜性和生物信息技術(shù)的局限性，此類(lèi)效應(yīng)因子目前還未有合適的生物信息學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，因此本研究?jī)H預(yù)測(cè)分析了通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體-質(zhì)膜經(jīng)典分泌途徑進(jìn)行分泌的效應(yīng)因子。本研究篩選出的候選效應(yīng)因子，為下一步驗(yàn)證候選效應(yīng)因子的作用，解析甘薯基腐病致病過(guò)程，指導(dǎo)甘薯抗病育種和農(nóng)藥靶標(biāo)研發(fā)等方面均奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

收稿日期：2022-05-06

基金項(xiàng)目：國(guó)家甘薯產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-10）

作者簡(jiǎn)介：唐 偉（1989-），男，山東泰安人，碩士，助理研究員，主要從事甘薯病蟲(chóng)害防治研究。（E-mail）tangv0001@163.com

通訊作者：孫厚俊，（E-mail）sunhoujun1980@163.com