基于COI 基因解析我國茶網蝽種群遺傳多樣性和遺傳結構

摘要：茶網蝽（Stephanitis chinensis）是我國西南茶區的重要害蟲，近年有入侵成災事件發生。為解析茶網蝽的生態適應機制和成災規律，測定了茶網蝽12 個種群共240 頭成蟲COI 基因序列，利用DnaSP 6.12.03、Arlequin3.5.2.2、MEGA 7.0.26 等軟件進行了遺傳分化程度、基因流（Nm）以及分子變異情況的分析。結果顯示，茶網蝽12 個地理種群的240 條COI 基因序列共包含75 個變異位點和38 個單倍型，其中僅Hap13 是共享單倍型。茶網蝽總群體的單倍型多樣性指數（Hd）為0.827 79，地理種群的Hd 在0.00～0.85，總群體的遺傳分化固定系數（FST）為0.864 26，Nm 為0.039 87，表明我國茶網蝽群體遺傳分化程度較高，基因交流較小。重慶城口、重慶巫溪、湖北恩施、湖北十堰、陜西漢中等5 個種群相互之間遺傳分化程度較低，基因交流頻繁（FST＜0.06，Nm＞4.50），其他種群對之間分化程度較高，基因交流較少（FST＞0.25，Nm＜1.00）。分子變異分析（AMOVA）支持遺傳分化主要來自于不同地理種群之間（86.43%）。Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗支持重慶巴南、湖北恩施種群以及大巴山脈周邊群體發生過種群擴張事件。本研究分析推測我國茶網蝽兼具入侵種群擴張成災和原始種群擴張成災的風險，建議有茶網蝽發生的茶區和大巴山脈周邊茶園加強對該害蟲的監測工作。

關鍵詞：茶網蝽；地理種群；COI 基因；遺傳多樣性；遺傳結構

中圖分類號：S571.1；S435.711 文獻標識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-795-11

茶網蝽（Stephanitis chinensis Drake），又名茶脊冠網蝽、茶軍配蟲、白紗娘等，隸屬于半翅目（Hemiptera）網蝽科（Tingidae）。茶網蝽成蟲和若蟲以刺吸式口器刺吸葉片汁液[1]，雌成蟲產卵于葉片組織，均會對茶樹葉片造成直接損傷[2]。此外，茶網蝽在葉片背面留下大量的黑色膠質排泄物和蛻殼易滋生霉菌，嚴重影響茶樹的光合作用[3-4]。茶網蝽為害嚴重時，會造成茶樹葉片脫落、樹體衰弱、茶芽萌發緩慢細小甚至發芽停滯[5-7]，進而影響茶葉的質量和產量，導致茶企、茶農的收入下降。茶網蝽具有繁殖力強、易擴散和多重危害等特點，但目前對該害蟲最有效的防控措施依然是藥劑防治[5，8-14]。由于氣候影響，重慶茶網蝽田間若蟲孵化期由早期文獻中的4 月上中旬[4，15]提前到3 月中下旬[16]，與春茶生產季的重合期增長，加大了對春茶生產的影響以及田間防治的難度。

茶網蝽一直是我國西南茶區的重要害蟲[15]，但早年少有其大量發生為害的報道，在中國知網檢索茶網蝽和茶脊冠網蝽可以發現2012 年以前僅有3 篇文獻[7，17-18]，2012—2017 年共13篇文獻，其中11 篇有關于陜西南部地區茶網蝽的發生與防治[5-6，9-11]，2018 年之后開始出現恩施及其他地區發生與防治技術的報道[3，8，13-14，16]。茶網蝽近年有明顯的蔓延擴散和暴發為害的跡象。本研究測定了5 省份下轄共12 個市（區、縣、州）的茶園的茶網蝽樣本COI 基因序列，并進行種群遺傳多樣性和遺傳結構分析，有助于從分子水平上解析該害蟲的生態適應機制和成災規律，為各茶區制定有效的防控策略提供基礎的遺傳學信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究測試茶網蝽成蟲和若蟲樣本于2022 年5 月—2023 年10 月采集于重慶、四川、貴州、湖北和陜西5 省份下轄12 個市（區、縣、州）的茶園（表1）。所采集若蟲均留于原附著枝葉和枝條下端保濕，置于智能人工氣候箱（CX-300h，上海將任實驗設備有限公司）飼養至羽化。氣候箱溫度為（26±1） ℃，光周期L∶D=14∶10，相對濕度（75±5）%。所有樣本均以成蟲在體視鏡下鑒定種類，浸泡于無水乙醇，置于–20 ℃冰箱中保存備用。

1.2 基因組DNA 提取

取茶網蝽成蟲單頭置于1.5 mL 離心管中，使用滅菌研磨棒研磨至粉末，采用DNeasyBlood amp; Tissue Kit 試劑盒（德國Qiagen 公司）進行基因組DNA 提取。提取產物用NanoVue超微量分光光度計（英國GE Healthcare 公司）檢測質量和濃度后置于–20 ℃冰箱保存備用。

1.3 PCR 擴增、測序及拼接

茶網蝽線粒體COI 基因序列的擴增引物參照懸鈴木方翅網蝽（Corythucha ciliata），上下游引物分別為5'-ATTTGGATTATGAGC AGGAATAGT-3'和5'-ATGTAAAATAAGCTCGTGTATCTAC-3'[19]。取2 μL PCR 產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。測序得到的序列使用DNAMAN 軟件進行拼接，拼接完成后的序列在NCBI 數據庫中進行BLASTn 比對，驗證序列的準確性。

1.4 數據整理與分析

利用DnaSP 6.12.03 軟件[20-21]計算茶網蝽不同地理種群的單倍型多樣性指數（Haplotypediversity，Hd）、核苷酸多樣性（Nucleotidediversity，π）、核苷酸平均差異數（Averagenumber of nucleotide difference，k）、種群間的遺傳分化固定系數（FST）等遺傳多樣性指標。基因流（Nm）依據公式Nm=（1－FST）/4FST計算[22]。在Arlequin 3.5.2.2 軟件[23]中使用Tajima’s D[24]和Fu’s Fs[25]統計進行中性檢驗，并進行種群的分子方差分析（ Analysis ofmolecular variance，AMOVA）。基于Kimura2-Parameter 模型使用MEGA 7.0.26 軟件計算種群間的遺傳距離[26]。采用Network 10.2 軟件繪制單倍型之間的進化網絡圖，單倍型的最大似然法系統發育樹使用PhyML 3.0（www.atgc-montpellier.fr/phyml）構建[27]。

2 結果與分析

2.1 茶網蝽COI 基因序列特征及變異情況

本研究對茶網蝽12 個地理種群共240 頭成蟲進行了DNA 提取，均完成擴增、測試和比對。240 條序列均為808 bp，A+T 含量約為67%，具有明顯的A、T 偏向性，符合昆蟲線粒體核苷酸組成特征。統計分析發現，COI序列在供試的240 個樣本中保守位點（C）733個，變異位點（V）75 個，約占全長的9.28%，無堿基缺失或插入現象。75 個變異位點中自裔位點（Si）21 個，簡約信息位點（Pi）54個，兩堿基變異（Two variants）位點72 個，三堿基變異（Three variants）位點3 個，共含有38 個單倍型：Hap1～Hap38（圖1）。

2.2 茶網蝽COI 基因序列單倍型及網絡進化關系

分析茶網蝽COI 基因序列的38 個單倍型，僅有1 個共享單倍型（Hap13），其出現頻率最高（92 次），占所有個體的38.3%，被城口、巫溪、恩施、十堰和漢中5 個種群共享（表2）。37 個單倍型為獨享單倍型，表明茶網蝽出現了較大程度的遺傳分化。從種群來看，巫溪、廣元、貴陽、六盤水、漢中種群內部無突變位點，各自僅有1 種單倍型，其他地理種群的單倍型在2～9 個范圍。利用中介鄰接網絡算法（Median joining network）構建38 個單倍型的進化網絡圖，結果顯示（圖2），茶網蝽單倍型的進化網絡呈散射狀，以中介點mv10 為中心，主要分為4 枝向外發展。由上而下，第1 枝包含11 個單倍型，涵蓋巴南和貴陽的所有單倍型及永川的2 個單倍型；第2 枝僅有3 個單倍型，涵蓋六盤水所有個體及永川剩余的2 個單倍型；第3 枝包含8 個單倍型，以共享單倍型Hap13為中心向外發展，涵蓋了城口、巫溪、廣元、恩施、十堰和漢中等位于大巴山脈周邊的6 個地理種群的所有單倍型，也是樣本量最大的一枝（共120 頭）；第4 枝包含有最多的單倍型（16個），但地理種群僅包含四川省的宜賓和樂山（圖2A）。單倍型進化網絡圖沒有顯示出較為明顯的祖先單倍型，也支持了我國茶網蝽遺傳分化程度較大的觀點。38 個單倍型的最大似然法系統發育樹顯示，進化網絡圖中的第2、3、4 枝上的單倍型均以較高的支持率各自聚為同一發育枝，并互為姊妹群，進化關系與進化網絡結構圖對應（圖2B）。

2.3 茶網蝽地理種群遺傳多樣性

茶網蝽總群體的COI 序列單倍型多樣性指數為0.827 79，核苷酸多樣性指數為0.017 69，核苷酸平均差異數為14.290 66（表3）。12個地理種群中，巫溪、廣元、貴陽、六盤水、漢中等5 個地理種群因不具有多態性位點，各項指數均為0，表明其內部序列保守，遺傳多樣性較低；其余7 個種群的單倍型多樣性指數在0.100 00～0.847 37，核苷酸多樣性指數在0.000 12～0.017 83，核苷酸平均差異數在0.100 00～14.405 26，茶網蝽在這7 個地理種群的遺傳多樣性差異較為明顯，其中永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群內部多態性位點較多，遺傳多樣性較高。對有多態性位點的7 個種群進行Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗，其中巴南和恩施種群的Tajima’s D 值顯著小于0，Fu’sFs 值極顯著小于0，說明這兩個種群偏離了遺傳平衡狀態，可能是種群擴張的結果。永川、城口、宜賓、樂山、十堰以及所有種群作為整體時的值均為不顯著，說明茶網蝽在這5 個地理種群和總群體進化都遵循中性進化模型，群體處于較穩定狀態。將圖2A 中以Hap13 為中心進化的6 個種群（城口、巫溪、廣元、恩施、十堰和漢中）作為群體進行檢驗，Tajima’s D和Fu’s Fs 值分別為–1.681 66（P＜0.05）和–5.664 72（P＜0.01），支持該群體發生過種群擴張事件。茶網蝽總群體的錯配分布圖有非常明顯的多峰（圖3），支持我國茶網蝽在整體上沒有發生擴張事件；其SSD 值（期望與觀測錯配分布之間的平方和）為0.038 50，rg 值（Harpending’s raggedness index）為0.046 91，兩個值均較小，且未達到顯著水平，推測我國茶網蝽總群體可能經歷了較弱的突然增長過程。

2.4 茶網蝽地理種群間的遺傳關系

茶網蝽COI 序列地理種群間的差異程度的遺傳學參數通過DnaSP 6.12.03 軟件計算。茶網蝽總群體的FST 為0.864 26（Plt;0.05），表明我國茶網蝽總體遺傳分化程度較高。各地理種群間的FST 在0.000 00～1.000 00（表4），其中有56 個種群對間FST 有顯著差異，且在0.259 44～1.000 00，表明這些種群對之間遺傳分化程度較高；城口與巫溪、恩施、十堰、漢中種群之間的FST 較小，在0.026 32～0.052 63，說明城口種群與這4 個種群之間的遺傳分化程度很低；巫溪、恩施、十堰、漢中4 個種群相互之間FST 值為0，表明4 個種群相互之間幾乎未發生遺傳分化。總群體的Nm 為0.039 87，種群對間的Nm 為0 到無限大，其中除巫溪、恩施、十堰、漢中4 個種群相互間Nm 為無限大；城口與巫溪、恩施、十堰、漢中種群之間的Nm 均大于4.5，推測城口種群與這4 個種群之間基因交流頻繁；其余種群對間的Nm 均小于1，表明這些種群相互間幾乎不發生基因交流。茶網蝽各地理種群之間的遺傳距離與地理距離相關性結果顯示，二者相關性系數為0.282（Plt;0.05），說明茶網蝽在不同地理種群間的遺傳分化與地理距離正相關（圖4）。

綜上所述，我國茶網蝽總群體遺傳分化程度較高，基因交流較少；而城口、巫溪、恩施、十堰、漢中5 個種群間分化程度較低，基因交流頻繁，其余種群對之間分化程度較高，基因交流較少。

2.5 茶網蝽的分子變異分析

利用Arlequin 3.5.2.2 軟件對茶網蝽的進行分子變異（AMOVA）分析，結果顯示，COI基因序列在茶網蝽12 個地理種群之間變異方差組分為6.631 03，占總方差比率的86.43%，種群內的變異方差組分僅為1.041 45，方差比率為13.57%，P 值均小于0.001，差異極顯著（表5），上述結果表明，COI 序列在我國茶網蝽這12 個地理種群的遺傳分化主要來自于種群之間，種群內部的遺傳分化相對較低，但對遺傳分化的作用不可忽視。

3 討論

本研究對12 個地理種群240 頭茶網蝽成蟲進行了COI 基因序列的擴增測序，共獲得了240 條808 bp 的核苷酸序列，A+T含量約為67%，明顯的A、T 偏向性符合昆蟲線粒體核苷酸組成特征[28-29]，序列中未發現終止密碼子，經比對確認為茶網蝽的COI 基因序列[30-31]。

從地理種群的單倍型數據來看，永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群的單倍型均大于5個，城口、恩施、十堰種群分別為4 個、3 個和2 個，巫溪、廣元、漢中、貴陽和六盤水均僅有1 個單倍型。前人研究認為，瓶頸和自然選擇作用通常能影響生物的遺傳多樣性，因此初始種群往往有更高的遺傳多態性，相反新傳入種群的多態性較低[32-33]，據此推斷，處于四川盆地內部的永川、巴南、宜賓、樂山4 個種群可能為原始種群，其余種群可能是新入侵種群。早期文獻記載，茶網蝽是西南茶區的固有害蟲，在四川、云南、貴州均有發生[15]，2010年傳入陜西南部漢中市和安康市并逐步向北部擴散[5，34]，2012 年在湖北恩施轄區內被初次發現[3]，并于2017 年暴發為害，受害茶園面積達0.48 萬hm2[14]。本研究顯示，恩施地區種群的Tajima’s D 和Fu’s Fs 中性檢驗值均顯著小于0，支持恩施種群發生過種群擴張事件。單倍型、進化網絡結構、系統發育樹、遺傳分化系數分析等均支持城口、巫溪、漢中、恩施、十堰5 個種群間有大量的基因交流，遺傳分化系數極小。這5 個種群與廣元種群的所有單倍型在進化網絡圖和系統發育樹上均聚在一起（圖2），6 個城市均坐落于我國大巴山脈，也位于茶網蝽早期蔓延點四川省萬源市和宣漢縣周邊，推測這6 個種群均為同一種群擴張而來。以這6 個種群作為群體進行中性檢驗，Tajima’s D 和Fu’s Fs 值分別為–1.681 66（Plt;0.05）和–5.664 72（Plt;0.01），支持該群體發生過種群擴張事件，因此筆者認為茶網蝽有入侵種群擴張暴發為害的風險。此外，巴南地區種群的兩個中性檢驗值也顯著小于0，同樣支持種群發生過種群擴張。前文分析巴南種群可能為原始種群，因此推測茶網蝽除了有入侵暴發的風險，也有本地原始種群在適宜的生態環境下種群擴張暴發的風險。茶網蝽COI序列的38 個單倍型中僅有Hap13 為城口、巫溪、漢中、恩施、十堰種群共享的單倍型，其余37 個單倍型均為獨享單倍型，種群間的FST也多處于較高水平，Nm 較低，均支持我國茶網蝽遺傳分化程度較大。AMOVA 分析表明，遺傳分化主要來自于種群之間。以上數據分析支持除大巴山脈周邊5 個種群外，茶網蝽種群之間基因交流較少，推斷該害蟲在茶區之間相互擴散遷移較少，擴散速度、距離較為有限。茶網蝽若蟲無翅，成蟲有翅但不善飛行[4，15]，其傳播更依賴于風力和人類活動。

綜上所述，我國茶網蝽具有入侵暴發成災的風險，但其擴散速度和距離較為有限，同時要防范本地原始種群在適宜生態環境下快速擴張暴發成災的風險。因此，建議大巴山脈周圍無茶網蝽發生的茶園應加強觀測，原發生區域在每年3 月下旬到4 月應定期開展茶園田間觀測工作，如發現有茶網蝽傳入或暴發的跡象，應及時采取有效防治措施。

致謝：感謝恩施土家族苗族自治州農業科學院羅鴻、陜西省漢中市鎮巴縣茶葉技術指導站唐志剛、湖北省農業科學院果樹茶葉研究所焦龍、四川省農業科學院茶葉研究所劉飛、四川省宜賓市茶產業研究院劉躍云、貴州省農業科學院茶葉研究所李帥對本研究樣品收集工作的支持。

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