全自動固相萃取結合UPLC-MS/MS 測定茶葉中的草甘膦及其代謝物

摘要：建立超高效液相色譜-質譜/質譜法（UPLC-MS/MS）測定茶葉中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析方法。用水-二氯甲烷體系對樣品進行提取和初步除雜，在全自動固相萃取儀中通過聚苯乙烯鍵合苯磺酸混合型陽離子交換柱進一步凈化樣品溶液基質，利用正交試驗和方差分析得出最優的衍生條件為5%硼酸鈉緩沖溶液和10 mg·mL-1 的9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-Cl）衍生劑在室溫下衍生2 h，衍生后的樣品溶液在HSS T3 色譜柱和5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈流動相體系下進行梯度洗脫分離，經UPLC-MS/MS 進行內標法定量分析。草甘膦和氨甲基膦酸在0.2～50 ng·mL-1 質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數（R2）均大于0.999，該方法的檢出限為2 μg·kg-1，定量限為5 μg·kg-1。低、中、高3 個加標水平（5、50 μg·kg-1 和250 μg·kg-1）的回收率為94.2%～106.7%，相對標準偏差為3.8%～4.9%。該方法具有高效率、高準確度、高通量、基質干擾小和自動化程度高等優點，適用于實驗室日常大批量茶葉樣品篩查草甘膦及氨甲基膦酸殘留的工作需求。

關鍵詞：草甘膦；氨甲基膦酸；全自動固相萃取儀；超高效液相色譜-質譜聯用儀

中圖分類號：S571.1；S482 文獻標識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-857-13

草甘膦（Glyphosate，Gly）是20 世紀70年代由孟山都公司發明的一種除草劑，由于其獨特的毒理作用方式、具有快速轉移至植物體內且無法解毒等特性，因而具有廣譜性、非選擇性和高效性，被廣泛應用于農田中，成為目前全球使用量最大的除草劑。草甘膦在植物中的作用方式是通過抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS），從而影響重要的芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）的產生，阻礙蛋白質合成和細胞生長，并最終導致細胞混亂和死亡[1]。草甘膦對其他生物的毒害作用仍存在較大的爭議[2]，草甘膦的大量使用不僅會使其在土壤中殘留，還會隨雨水和灌溉水等污染地下水，最終通過食物鏈富集進入人體，產生潛在毒性[3-4]。相關研究顯示，草甘膦不僅對小鼠肝細胞色素酶活性有抑制作用[5]；還能明顯地誘發黃鱔染色體數目和結構畸變率上升[6]；使經口染毒小鼠的精子形態發生畸變[7]；對人體產生潛在的致癌風險[8-10]。我國作為茶樹種植大國和茶葉主要出口國，通過化學農藥防治茶樹病蟲害，極易造成農藥殘留超標[11]。其中，草甘膦作為常用且大量使用的除草劑，歐盟規定其最大殘留限量為2.0 mg·kg-1，而我國GB 2763—2021 則規定了更為嚴格的最大殘留限量為1.0 mg·kg-1，予以保障我國茶葉質量安全和茶葉出口貿易的穩定發展。

草甘膦因其結構上含有氨基和膦酸基兩性極性基團而具有強親水性，容易發生降解并產生代謝物氨甲基膦酸（Aminomethylphosphonicacid，AMPA）[12]。目前的檢測方法主要有免疫檢驗法[13]、氣相色譜法[14]、高效液相色譜法[15]、毛細管電泳法[16]、離子色譜法[17]、氣相色譜-質譜聯用法[18]、高效液相色譜-質譜聯用法等[19-20]，但其中大部分的檢測方法前處理過程繁雜，日常可操作性低，靈敏度低，檢出限/定量限高。其中，高效液相色譜-質譜聯用法，因具有高靈敏度和高選擇性，是目前常用的檢測方法。茶葉基質復雜，茶湯中含有大量色素、多酚類、生物堿、多糖和氨基酸等化合物，高效液相色譜-質譜聯用法存在基質干擾效應[21]，因此高效快捷地凈化茶葉中的干擾基質非常關鍵。目前我國尚未實施檢測茶葉中草甘膦的相關國家標準，而GB 2763—2021中所推薦的SN/T 1923—2007 在日常試驗操作時，存在過程繁雜、試劑復雜多樣、凈化柱價格高、洗脫液中水難以蒸干、衍生時間過長和重現性差等問題。因此，建立一種針對茶葉基質的高效、可靠和便捷的檢測方法，對于提高茶葉市場監督效率和保障人們飲茶健康具有重大意義。

現有對凈化方法的研究多采用QuEChERS 法[22-23]和專用柱固相萃取法[24-25]，并取得了一定成效。其中QuEChERS 法需要嚴格控制凈化材料的量值和種類；傳統固相萃取柱凈化時需進行繁雜的洗脫、濃縮等步驟；草甘膦專用柱能有效縮短凈化流程，但成本較高，不適用于日常大批量檢驗。因此，本研究探索一種采用實驗室常見且價格較低的固相萃取柱進行過濾式凈化的方法，柱子可吸附多酚、色素、生物堿和氨基酸等干擾雜質，同時對草甘膦和氨甲基膦酸的保留作用較小，并配合內標法定量以校正目標化合物的損失，做到無需洗脫和濃縮，凈化液直接進行快速衍生后上機測定，在保證成本效益的同時大大縮短試驗時間。

本研究采用一級水對茶葉樣品中的草甘膦和氨甲基膦酸進行提取，使用二氯甲烷初步除雜，經全自動固相萃取儀進行凈化，探究UPLC-MS/MS 的質譜檢測參數、液相色譜條件、最佳的衍生反應條件，對比不同固相萃取柱的凈化效果以及不同種類茶葉的基質效應（Matrix effect，ME），用超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀進行測定，采用內標法進行定量，運用正交試驗方法設計合理的試驗方案，并結合SPSS 數理統計軟件對數據進行分析運用，以期建立一個應用于茶葉基質中草甘膦和氨甲基膦酸的高效、準確和高靈敏度的檢測方法，為今后相關標準的制定提供數據參考，亦為茶葉的市場監管效率和茶葉市場安全提供技術理論保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

ExionLC 液相色譜儀、SCIEX Triple Quad5500+三重四極桿質譜儀，美國AB SCIEX 公司；Fotector 高通量全自動固相萃取儀，中國?？萍瘓F股份有限公司；BC-1000 渦旋振蕩儀，深圳逗點生物技術有限公司；CPX880H-C超聲波清洗機，美國Branson 公司；3k15 高速冷凍離心機，德國Sigma 公司；MiniSpin 離心機，德國艾本德公司。

1.2 材料與試劑

草甘膦、氨甲基膦酸（純度99.9%）、同位素內標1，2-13C15N 草甘膦（100 μg·mL-1）購自北京曼哈格生物科技有限公司；二氯甲烷、甲酸（色譜純）、硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O，優級純）購自天津科密歐化學試劑有限公司；甲醇、乙腈（色譜純）購自德國默克公司；9-芴基甲基三氯甲烷（FMOC-Cl，分析純）購自上海阿拉丁試劑有限公司；乙酸銨（色譜純）購自山東西亞化學股份有限公司。茶葉樣品為東莞市市場監管抽檢樣品及部分市場自購。

C18 固相萃取柱（500 mg/6 mL），北京艾杰爾科技有限公司； 親水親脂平衡小柱（Hydrophile-lipophile balance，HLB）、混合陰離子交換柱（Mixed-mode anion exchanger，MAX）、混合陽離子交換柱（ Mixed-modecation exchanger，MCX）（500 mg/6 mL），美國Waters 公司。

1.3 標準溶液及試劑的配制

1 mg·mL-1 草甘膦、氨甲基膦酸標準儲備溶液的配制：分別準確稱取10.0 mg 草甘膦和氨甲基膦酸標準品于10 mL 容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

10 μg·mL-1 草甘膦、氨甲基膦酸混合標準工作溶液的配制：分別準確移取100 μL 草甘膦和氨甲基膦酸標準儲備溶液（1 mg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

10 μg·mL-1 1，2-13C15N 草甘膦內標標準工作溶液的配制：準確移取1.00 mL 1，2-13C15N草甘膦標準溶液（100 μg·mL-1）于10 mL 容量瓶中，用水溶解后定容至刻度，于4 ℃冰箱中避光保存。

標準工作曲線：移取上述標準溶液，分別以水和空白茶葉基質提取液為稀釋液，逐級稀釋，加入適量的內標標準工作溶液，配制成草甘膦和氨甲基膦酸的質量濃度為0.2、1、2、5、10、20、50 ng·mL-1 的標準工作曲線，其中內標1，2-13C15N 草甘膦的質量濃度為20 ng·mL-1，配制完成后與樣品一起進行衍生化反應。

硼酸鈉溶液：分別稱取3.0、5.0、7.0 g硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O），用水溶解并定容至100 mL，配制濃度分別為3%、5%、7%。FMOC-Cl 乙腈溶液：分別稱取0.1、0.5、1.0 g FMOC-Cl，采用乙腈溶解并定容至100 mL，配制成質量濃度分別為1、5、10 mg·mL-1 的FMOC-Cl 乙腈溶液。

1.4 樣品前處理

提取：稱取粉碎后的茶葉樣品1.0 g，加入10 μg·mL-1 的1，2-13C15N 草甘膦內標標準工作溶液20 μL，加10 mL 水于50 mL 塑料離心管中，混勻，超聲20 min，再加入10 mL 二氯甲烷，渦旋振蕩1 min，于9 500 r·min-1 離心5 min，上清液待凈化。

凈化：分別移取6 mL 甲醇和6 mL 水依次活化固相萃取柱，取3 mL 待凈化液上樣，棄去凈化液，再取2 mL 待凈化液上樣，收集凈化液，混勻，待衍生。

衍生：取上述凈化液及各標準工作曲線點500 μL，加入200 μL 5%硼酸鈉溶液，渦旋混勻1 min，加入300 μL 衍生劑10 mg·mL-1FMOC-Cl 乙腈溶液，室溫衍生2 h，10 000 r·min-1下離心5 min，衍生液過0.22 μm 濾膜，進UPLC-MS/MS 分析檢測。

1.5 全自動固相萃取儀方法

固相萃取方法在全自動固相萃取儀中的參數設置如表1 所示。

1.6 液相色譜-串聯質譜條件

色譜柱為WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動相A 為5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸），流動相B 為乙腈，進樣量為5.00 μL，柱溫為40 ℃，液相色譜洗脫程序如表2 所示。

質譜電離方式為正離子模式（ESI+），掃描模式為多反應監測（MRM），電離電壓（IS）為5 500 V，輔助加熱器溫度為550 ℃，氣簾氣（CUR）為35 psi，碰撞氣（CAD）為7 psi，霧化氣（GAS1）為50 psi，輔助氣（GAS2）為50 psi。

1.7 數據處理

通過AB SCIEX 上機處理軟件進行數據采集，采用MultiQuant 軟件對數據進行分析計算，使用Origin 2021 軟件繪制總離子流圖；采用WPS Office 計算回收率、相對標準偏差以及繪制柱狀圖等；運用SPSS 24.0 進行數據方差分析。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

將草甘膦、氨甲基膦酸和1，2-13C15N 草甘膦內標單標溶液按照1.4 章節中的衍生方法進行衍生，分別在電噴霧正離子模式下進行掃描，通過調節去簇電壓和碰撞電壓，選出響應高且穩定的母離子和子離子，質譜參數如表3所示。

2.2 液相條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇

FMOC-Cl 常用作氨基酸分析中的衍生劑，作為氨基酸的保護基團[26-28]，在氨基酸類農藥的檢測分析中也發揮著重要的作用。草甘膦和氨甲基膦酸的極性大且分子量小，直接利用反相色譜串聯質譜測定時，難以保留且干擾大。草甘膦和氨甲基膦酸衍生化反應后，帶有1 個氨基保護基團，極性大大降低，在C18 反相色譜柱上能有較好的保留[29-34]。本研究采用WATERS ACQUITY UPLC? BEH C18、ThermoHypersil GOLDTM 和WATERS ACQUITY UPLC?HSS T3 3 種色譜柱進行探究，用空白茶葉提取液配制的標準溶液上機測定，其中WATERSACQUITY UPLC? BEH C18色譜柱的色譜峰峰形較寬且響應較低；Thermo Hypersil GOLDTM色譜柱的色譜峰有拖尾現象； WATERSACQUITY UPLC? HSS T3 色譜柱分離的色譜峰峰型對稱、尖銳且響應值高，能有效分離茶葉基質中的雜質干擾，因此選擇該色譜柱進行分析。

2.2.2 流動相的優化

分別以純水、0.1%甲酸水溶液和5 mmol·L-1乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）作為流動相A，乙腈作為流動相B，對比目標化合物的峰型和響應大小。測定結果發現，以純水作為流動相A 時，目標化合物沒有出峰；在純水相中加入0.1%甲酸后目標化合物能有效出峰，這是因為采用正離子模式進樣時，目標化合物需要在高壓電離時帶上1 個質子，而衍生后的樣品溶液為堿性，流動相中的酸可在電離時為目標化合物提供質子。在0.1%甲酸水中加入5 mmol·L-1乙酸銨，目標峰峰形尖銳對稱，能有效改善流動相中只含甲酸時峰形拖尾的現象。因此最終選擇5 mmol·L-1 乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）-乙腈作為本次試驗的流動相體系。

2.3 凈化方式的選擇

取空白茶葉樣品加標提取液經固相萃取柱進行凈化處理，用全自動固相萃取儀進行樣品的凈化，包括固相萃取柱的活化、樣品上樣和接收等步驟，在12 min 以內即可完成60 批次樣品的固相萃取過程，實現便捷、高通量固相萃取，能應對大批量的日常監管任務。該儀器通過數控加壓泵按照設置的參數精準控制上樣和洗脫速度，有效減少人工操作時的誤差、耗時長和柱子堵塞等問題，可大幅提高檢測的效率，相比于傳統手動固相萃取，全自動固相萃取的數據精密度更高[12，24，31]，同時還減少了操作人員在化學氣霧中的暴露風險。

2.3.1 探究不同固相萃取柱的凈化步驟

考慮到不同固相萃取柱中填料對目標化合物吸附性質的差異性，故進行凈化液試驗，以探究不同固相萃取柱的凈化步驟。MAX 和MCX 柱均為強離子交換柱，在水相中即可呈離子狀態，與C18、HLB 柱一樣使用甲醇和水即可完成柱子的活化。結果顯示，每種固相萃取柱的凈化液中均檢測出目標化合物，且因前3 mL 凈化液中混有用于活化的溶液使得目標化合物濃度均小于后2 mL 凈化液，故選擇后面2 mL 的凈化液作為樣品溶液進行試驗。因本研究使用內標法，在滿足檢出限的前提下不考慮目標化合物是否完全洗脫的問題，不進行后續的洗脫液試驗，省略后續的洗脫、氮吹和復溶步驟，能有效提高試驗的效率。

2.3.2 固相萃取柱的選擇

茶葉中含有的茶多酚、咖啡堿、多糖、脂質和氨基酸等物質會影響目標化合物衍生化反應并對質譜具有極強的抑制作用[31]，草甘膦和氨甲基膦酸中同時含有酸性基團（羧酸基團、膦酸基團）和堿性基團（氨基酸基團），是具強極性的兩性化合物。根據目標化合物和雜質的特性，本研究采用實驗室常見的C18、HLB、MAX 和MCX 柱進行探究。各固相萃取柱的凈化效果如圖1 和圖2 所示，經C18、HLB 和MAX 柱凈化后的目標峰附近存在較多雜峰，而經MCX 柱凈化后目標峰附近較干凈、無雜峰，且回收率較其他3 種固相萃取柱大，回收率在97.5%～102.9%。

C18 柱為反相吸附作用，對茶湯中的極性雜質保留作用較小，凈化后的茶湯顏色深，未能很好地吸附色素；HLB 柱對極性和非極性物質均有較好的保留作用，可吸附茶葉中的大部分雜質，凈化后的茶湯顏色較淡，對目標化合物也有較強的保留作用，需配合后續的洗脫步驟；MAX 柱同時具備反相吸附和陰離子交換作用，能較好地吸附色素等雜質，凈化后茶湯淡，對目標化合物有很強的保留作用，需配合相應的酸洗脫步驟才能更好地將目標化合物洗脫下來；MCX 柱可同時發揮反相萃取和陽離子交換作用，能有效吸附多糖、脂質、色素、生物堿和堿性氨基酸等非極性、弱極性物質和堿性物質；茶湯pH 在5.5～7.0，茶多酚在酸性條件下以中性分子存在而被反相吸附；同時，因目標化合物為特殊的強極性兩性物質，其解離常數pKa1=2.3、pKa2=5.7、pKa3=10.9[35]，pH 在pKa2 和pKa3 之間時主要以陰離子形式存在，因而較少量被陽離子交換柱吸附，大部分目標化合物隨凈化液分離流出；凈化后的茶湯顏色淡，雜質干擾少。未經凈化的茶湯以及經二氯甲烷和各固相萃取柱凈化后的茶湯顏色如圖3 所示。因本試驗旨在探究一種過濾式固相萃取法，綜合對比分析，最終選擇除雜效果好、回收率高且無需進行洗脫步驟的MCX混合型陽離子交換柱作為本研究的前處理凈化柱。

2.4 凈化條件的優化

正交試驗設計及結果如表4 和表5 所示，根據各ki 值的大小可判斷草甘膦和氨甲基膦酸衍生條件的優組合分別為A3B3C1 和A3B3C3。表6 方差分析結果顯示，因素A 和因素B 對草甘膦結果有顯著影響（Plt;0.05），而因素C 對草甘膦結果無顯著影響（Pgt;0.05）；各因素對氨甲基膦酸結果均無顯著影響。結合表5 中的優組合，考慮到高濃度的緩沖鹽進入質譜容易污染離子源，且因素A 對草甘膦衍生反應的k2 與k3 值之間的差異性較小，綜合考慮經濟和環保效益，最終選擇A2B3C1，即緩沖鹽濃度為5%、衍生劑濃度為10 mg·mL-1、衍生時間為2 h，作為本研究的最佳衍生條件。

相比于SN/T 1923—2007 中的過夜衍生方法，本方法極大縮短了試驗時間?，F有文獻中大部分采用逐步控制變量法對緩沖鹽濃度、衍生劑濃度以及衍生時間進行探究[36-37]，但這種探究變量的方法可能存在片面性、代表性不強等限制，本研究將提取工藝中常用的正交試驗法運用至食品檢測前處理條件的優化中，充分考慮了因素的主次關系，高效快捷地選擇出最優組合。

2.5 標準曲線和基質效應

分別以純水和4 種類別的空白茶葉樣品提取凈化液作為溶劑配制混合標準溶液，結果如表7 所示。一般認為基質效應在85%～115%時不存在或基質效應不顯著[38-39]，在外標法的線性方程中可以看出草甘膦在4 種茶葉基質中均具有基質增強效應，氨甲基膦酸均產生基質抑制效果；加入內標后，可將草甘膦的基質效應在定量分析時進行校正，但對氨甲基膦酸不起作用。這是因為基質對草甘膦以及內標1，2-13C15N 草甘膦具有相同程度的基質增強效應，而對氨甲基膦酸則具有基質抑制效應，因此使用內標法時可用內標對草甘膦的基質增強效應進行校正，對氨甲基膦酸的基質抑制效應不具有校正作用。所以需要使用空白茶葉基質配制系列標準溶液以校正目標化合物的基質效應，同時用內標法進行擬合繪制標準工作曲線以校正試驗過程中目標化合物的損失。在4 種茶葉基質中的內標法標準曲線中，草甘膦和氨甲基膦酸線性方程的斜率間的精密度高、差異性小，在試驗中使用其中1 種類型的空白茶葉基質做基質標準曲線即可。

2.6 檢出限和定量限

在多份空白茶葉樣品中分別加入系列經稀釋的標準溶液，按1.4 章節樣品前處理進行操作，上機測定。當目標峰定性離子對的響應值約為基線噪音的3 倍（信噪比S/N≥3）及10 倍（信噪比S/N≥10）時，所對應空白茶葉樣品中添加的質量濃度水平則為方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。草甘膦和氨甲基膦酸的LOD 均為2 μg·kg-1，LOQ 均為5 μg·kg-1。

2.7 加標回收及精密度

在空白茶葉樣品中分別加入5、50μg·kg-1和250 μg·kg-1（1 倍、10 倍和50 倍定量限水平）的混合標準溶液，按1.4 章節進行操作。結果如表8 所示，回收率范圍為94.2%～106.7%，相對標準偏差范圍為3.8%～4.9%，符合GB/T 27404—2008 附錄F 的要求，表明該試驗具有良好的適應性和精密度。

2.8 實際樣品的測定

采用上述優化后的方法對市售茶葉樣品（共50 批）進行檢測，結果如表9 所示，草甘膦殘留量均符合我國國家標準（ GB2763—2021）中制定1.0 mg·kg-1 的限量要求。

3 結論

本研究建立了超高效液相色譜-質譜/質譜法測定茶葉樣品中的草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的方法，用水-二氯甲烷提取凈化體系對茶葉進行提取及初步除雜，運用全自動固相萃取儀完成樣品溶液在MCX 混合陽離子交換柱中的進一步凈化，利用正交試驗和方差分析得出最優的凈化條件：5%硼酸鈉緩沖溶液、10 mg·mL-1 FMOC-Cl 衍生劑和2 h 衍生時間，采用基質標準曲線同位素內標法進行定性定量分析。該方法具有操作簡單、高自動化、高通量且高精密度等優點，在保證定量結果準確性的同時大大縮短了前處理時間，能夠較好地滿足實驗室日常對茶葉中草甘膦及氨甲基膦酸殘留的大批量檢測需求，為茶葉安全及質量控制提供了技術支持與保障。

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