茶樹春季發芽期的QTL 定位及候選基因分析

摘要：春季發芽期（Timing of spring bud flush，TBF）是茶樹重要的農藝性狀，對茶葉的風味品質和經濟效益均具有重要的影響。為了挖掘調控茶樹TBF 性狀的關鍵候選基因，以龍井43×白毫早雜交的F1 群體327 株子代為材料，利用基于該群體構建的茶樹高密度遺傳圖譜，采用MapQTL 6.0 和GACD 1.2 軟件對茶樹春季發芽指數（Sprouting indexs，SPI）進行數量性狀基因座（QTL）定位。連續兩年（2022、2023 年）對群體子代的春季SPI 進行觀測，結果顯示，SPI 在F1 群體內存在明顯的性狀分離，表現出數量性狀的特征。利用MapQTL6.0 軟件定位到1 個主效的QTL（qSPI-5-1），分別可解釋18.30%（2022 年）和7.60%（2023 年）的表型變異；利用GACD 1.2 軟件定位到2 個穩定的QTL 位點（qSPI-1，qSPI-5-2），解釋2.75%～18.40%的表型變異，且qSPI-5-2 與qSPI-5-1 位點基本重合。進一步將上述3 個位點的置信區間與茶樹參考基因組進行比對，通過基因功能注釋分析共篩選到23 個與調控茶樹春季發芽期相關的候選基因。研究結果為進一步探究茶樹春季萌發的調控基因和分子機理提供了理論參考。

關鍵詞：茶樹；春季發芽期；數量性狀基因座；候選基因

中圖分類號：S571.1；S326 文獻標識碼：A 文章編號：1000-369X（2023）06-747-10

茶樹[Camellia sinensis （L.） O. Kuntze]是多年生常綠木本經濟作物。茶樹芽葉經加工制成的茶葉，因富含多種對人體健康有益的次生代謝物以及具有良好的風味品質而受到人們喜愛[1-3]。糧農組織統計數據庫（FAOSTAT，www.fao.org/faostat）顯示，目前已有超過48個國家種植茶樹，茶樹已經成為全球范圍內重要的經濟作物。春季發芽期（Timing of springbud flush，TBF）是茶樹重要的農藝性狀，具有早芽性狀的茶樹品種具有較高的栽培育種價值。一方面，茶樹經過一個冬季的休止期，春季新梢積累了更多的次級代謝物，使得茶葉品質優異；另一方面，春季發芽較早的茶樹品種其茶葉上市早，春茶采收期長，使得春茶產量和經濟效益提高。

研究表明，即使在相同的生長環境下，不同茶樹品種的TBF 差異仍然很大，最大可相差40 d[4]。為明確TBF 的調控機制和重要基因，科學家們也開展了相應的研究。Wang 等[4]使用抑制差減雜交（ Suppression subtractivehybridization，SSH）的方法研究了休眠和萌發腋芽的差異表達基因（ Differentiallyexpressed genes，DEGs），主要涉及脅迫反應、能量代謝和激素調節等。Hao 等[5]利用轉錄組測序技術（RNA-seq）分析了腋芽的休眠期和萌發期等不同時期的基因表達量，發現16 125個DEGs，主要富集在表觀遺傳、植物激素信號、胼胝體等調控通路。Tan 等[6]通過對休眠芽和萌發芽差異表達基因分析發現，MADS、NY-FC、AP2-ERFs 等轉錄因子和植物激素相關基因可能調控茶樹休眠和萌發。近期，Liu等[7] 鑒定到了9 個與茶樹萌芽有關的CsAP2/ERF 基因，同時發現D-type 周期蛋白可能與茶芽萌發有關。然而，這些重要的候選基因仍需要進一步的功能驗證。

數量性狀基因座（Quantitative trait locus，QTL）定位研究需要構建龐大的作圖群體，并對作圖群體進行基因組水平的測序，以構建高密度遺傳圖譜，結合表型觀測結果，進行QTL定位分析。但是茶樹育種周期長、自交不親和，難以像水稻、小麥等一年生大田作物一樣構建永久作圖群體，這使得利用正向遺傳學方法解析茶樹重要農藝性狀進展緩慢。近年來，隨著茶樹高質量參考基因組的發布，結合茶樹基因組具有高雜合度的特性，使得采用F1 代擬測交作圖策略[8]研究茶樹QTL 定位取得一定進展。前期課題組以龍井43 和白毫早為親本構建了F1 代雜交群體，并構建了高密度茶樹遺傳圖譜[9]。龍井43 和白毫早都屬于國家級特早生茶樹品種，觀測發現TBF 性狀在子代群體中發生了明顯的性狀分離，有利于QTL 定位分析。本研究以此為基礎，對茶樹TBF 進行了連續兩年的QTL 定位研究，并分析了置信區間內的候選基因，以期為茶樹分子標記輔助育種提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

龍井43（C. sinensis var. sinensis ‘Longjing43’ ） 和白毫早（ C. sinensis var. sinensis‘Baihaozao’）及其327 個F1 雜交子代均種植在中國農業科學院茶葉研究所嵊州綜合試驗基地（29°44′N，120°49′E），正常水肥管理。

1.2 TBF 表型觀測

茶樹TBF 表型觀測參考文獻[10]，使用發芽指數（Sprouting indexs，SPI）來代表茶樹春季發芽狀態。通過春季在田間觀測，待群體大多數子代已經萌發時（2022 年3 月16 日和2023 年3 月24 日）觀測親本及其F1 群體子代發芽指數，每根粗壯枝上選擇5 個腋芽進行發芽指數評分，取平均值代表子代的發芽狀態。

而MapQTL 6.0 在2022 年和2023 年的春季SPI數據中僅僅定位到1 個穩定的QTL（qSPI-5-2，圖2B），該位點同樣位于5 號連鎖群上，且該位點與GACD1.2 在5 號連鎖群上定位到的QTL幾乎重合，該位點在連續兩年觀測的表型數據QTL 定位結果中相同峰值標記距離極近，但不相同，分別為AX-414610507（2022 年）和AX-416494071 （ 2023 年）， LOD 范圍為5.54～14.02，隨后在兩年的表型觀測中以峰值標記閾值LOD-1 所覆蓋到的分子標記的共同置信區間作為該QTL 位點置信區間，大小為6.65 cM。qSPI-5-2 的PVE 分別為18.30%和7.60%，由此可知，該位點是調控茶樹春季SPI性狀效應最強的QTL。

2.3 QTL 內重要候選基因的分析

在以往的工作中，已經建立了該遺傳群體的連鎖群與茶樹基因組染色體對應的關系[12]，并且它們之間具有良好的共線性，這為尋找QTL 置信區間內參考基因提供了便利[9，11-12]。利用QTL 兩端的標記序列與舒茶早茶樹參考基因組進行比對，將QTL 區間比對到茶樹參考基因組上。結果如圖3A 所示，LG1 對應1號染色體，該置信區間在染色體上的大小為9.24 Mb，包含199 個基因；而LG5 上的qSPI-5-1 和qSPI-5-2 對應到4 號染色體上，為了盡可能不遺漏調控茶樹TBF 的候選基因，qSPI-5-1 和qSPI-5-2 位點包含的全部置信區間比對到序列長度為20.76 Mb 的茶樹染色體上，該區間內含有505 個基因。

為了進一步明確候選基因的功能，尋找到可能調控茶樹TBF 的重要候選基因，對兩個QTLs 內704 個候選基因進行GO、KEGG、pfam注釋（表3），分別獲得377、235、520 個候選基因。646 個基因具有非冗余蛋白功能注釋（Non-redundant protein sequence database，NR）信息。參考基因富集通路、功能注釋信息以及查閱文獻，找到23 個與茶樹TBF 可能相關的重要候選基因，包括幾類轉錄因子如AP2/ERF（CSS0034219，CSS0001166）、WRKY（CSS0023134，CSS0005560）、MYB（CSS0013678，CSS0011420）、Dof（CSS0039246，CSS0048433）；還包括部分植物激素調控基因，如調控脫落酸（Abscisic acid，ABA）信號轉導的蛋白激酶（ Serine/threonine-protein kinase ， SRK2E ）（CSS0020459，CSS0033957），ABA 受體蛋白Pyrabatin riesistance1-like （ PYL ）（ CSS0027957 ， CSS0015228 ）、RABE1a（CSS0000976，CSS0006593），以及生長素調控基因AUX1（CSS0046696），參與油菜素內酯信號的BSK 基因（CSS0028616），GA 信號相關的Ataxin-3（CSS0046643）。另外發現4個F-box 蛋白（CSS0029544、CSS0036037、CSS0044623、CSS0018234）。

這23 個重要候選基因在茶樹頂芽、嫩莖、根等8 個不同器官的基因表達量如圖3B 所示，AP2/ERF（CSS0034219，CSS0001166）和MYB（CSS0013678）在茶樹不同器官的表達模式相同，在芽和嫩莖中表達量明顯低于在其他器官中的表達量； 而Expansin-A8-like（ CSS0008650 ， CSS0010195 ） 、Dof（CSS0039246，CSS0048433）與上述表達模式相反，在頂芽和嫩莖中的基因表達量較高。

3 討論

3.1 茶樹TBF 的QTL 定位分析

為尋找調控茶樹TBF 的主效QTL，應用于分子標記輔助育種，加快茶樹育種效率[18]，已有學者針對茶樹TBF 進行了相關研究，如Tan 等[9]使用SSR 分子標記對龍井43×白毫早構建遺傳連鎖圖譜，并對TBF 進行QTL 定位，在5 號連鎖群上獲得QTL 位點，與本研究結果一致。此外，Wang 等[19]對151 份茶樹種質資源使用全基因組關聯分析（Genome-wideassociation study， GWAS）確定了1 個與TBF顯著相關的SNP 位點（Sc0002405-269473），該位點位于茶樹第13 號染色體上，并開發了與TBF 相關的dCAPs 標記。Tan 等[10]以峨眉問春×川沐217 為親本構建F1 雜交群體，并對TBF 進行QTL 定位，找到2 個穩定的QTLs，其中1 個穩定且主效的QTL（qSPI-4）與本研究的qSPI-5 位點相重合，推測在該置信區間內存在調控茶樹TBF 性狀的重要候選基因。

本研究在本課題組前期開發的茶樹高密度遺傳圖譜基礎上， 使用GACD 1.2 與MapQTL 6.0 軟件進行茶樹TBF 的QTL 定位研究，發現兩者都能穩定定位到調控TBF 最主效的QTL 位點（qSPI-5），同時發現GACD1.2 軟件較MapQTL 6.0 軟件能夠定位到多1個但效應較小的QTL（qSPI-1），前人的研究結果也同樣證明了該結論[20-21]。但是，在主效QTL 位點上（qSPI-5），兩個軟件定位的置信區間卻不完全相同，qSPI-5-2（GACD 1.2）的置信區間在連鎖群末端偏上位置（131.74～143.48 cM），而qSPI-5-1（MapQTL6.0）更靠近連鎖群的末端（140.38～147.03 cM）。

在MapQTL 6.0 軟件定位的QTL（qSPI-5-1）內，多個位置出現LOD＞3 但是不連續的峰型，推測在該主效QTL 位點上可能存在多個調控TBF 的基因。

3.2 茶樹TBF 的候選基因分析

隨著茶樹高質量參考基因組的發布[17，22-23]，加速了茶樹遺傳育種的研究，也使通過QTL定位尋找候選基因成為可能。本研究將TBF相關QTL 兩端的序列與茶樹參考基因組進行比對，并在置信區間內尋找候選基因。本研究發現的2 個穩定QTL（qSPI-1，qSPI-5）的置信區間大小分別為9.24 Mb 和20.76 Mb。通過分析基因注釋和查閱參考文獻，在置信區間內找到23 個重要的候選基因，期望對將來的基因功能驗證提供線索。

在這些候選基因中，發現幾類重要的轉錄因子，如AP2/ERF、WRKY 和MYB。AP2/ERF 基因家族在茶樹春季發芽中發揮著重要作用[7]，AP2/ERF （ CSS0001166 ） 與擬南芥中的AtDREB-2C 為同源基因，該基因過表達會使擬南芥種子萌發延遲和ABA 含量增加[24]。

WRKY（CSS0023134，CSS0005560）和MYB（CSS0013678，CSS0011420）是調節ABA 信號的重要轉錄因子，可能調控植物的休眠和萌發[25]。此外，還發現了許多與植物激素相關的基因， 如2 個SRK2E （ CSS002045 ，CSS0033957）基因，它們調控ABA 信號轉導從而影響植物的休眠和萌發。研究發現，在擬南芥SRK2E 缺失突變體中，擬南芥的種子無法休眠，且ABA 含量出現顯著升高[26]。在水稻中過表達SRK2E 同源基因（SAPK10）會使種子萌發延遲[27]。此外，還發現2 個RABE1a（CSS0000976，CSS0006593）基因，在擬南芥中RABE1a 能夠與質膜上的ABA 受體結合，從而正向調節ABA 信號傳導，且能抑制ABA受體PYL（CSS0027597，CSS0015228）的積累[28]。同時發現了參與調控油菜素內酯（BR）的BR-signaling kinase（BSK，CSS0028616），以及生長素調控基因AUX1（CSS0046696）。在該區間還存在多個F-box 蛋白，有研究報道[29]它們可以調控乙烯、赤霉素（GA）、IAA 等植物激素，從而影響植物的休眠與萌發。另外，在這些候選基因中發現2 個膨脹素基因Expansin-A8-like（CSS0008650，CSS0010195），二者在茶樹不同器官的基因表達模式相同，但是在頂芽和嫩莖中表達量明顯高于在其他器官中的表達量。有研究報道Expansin-A8-like僅在萌發的種子中表達，而且在種子萌發后嫩莖的初期生長階段該基因也參與其中[30-31]；同時，它們的同源基因AtEXP2 在擬南芥中過表達能使種子提前萌發[32]。上述基因在其他植物中的相關功能已經有所報道，所以推測它們在茶樹的休眠和萌發中也發揮一定的作用。

3.3 基于遺傳圖譜精細化定位的分析與展望

基于遺傳連鎖圖譜進行QTL 定位是研究數量性狀經典的遺傳學方法[33]。影響遺傳圖譜質量的重要因素是群體單株數量以及分子標記數量[34]。由于茶樹自交不育的特性，以及幼年期往往超過3 年，采用人工雜交方式繁育單株費時費力，所以培育合適數量的茶樹群體較為困難，導致茶樹正向遺傳學的研究進展緩慢。在茶樹上，遺傳圖譜作圖群體數量≥200，平均分子標記＜0.5 cM 的茶樹遺傳圖譜至今僅有2 張[10，12]。本研究使用的遺傳圖譜（n=327）和平均分子標記間距排名都居于前列，但是定位的TBF 的置信區間仍較大，難以精細定位到候選基因，僅僅依靠增加群體數量來進一步精細定位置信區間難以實現。將來可以在置信區間內開發更多數量的分子標記，從而進一步縮小候選區間來鎖定重要基因；或通過QTL 定位與RNA-seq 相結合的方式提供更多的信息從而確定候選基因；以及利用分離群體分組分析法（Bulked segregation analysis）[35]篩選差異基因片段。這些都是基于遺傳群體用來快速精細定位候選基因的有效方法。

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