輪作模式對冬小麥土壤氨氧化微生物群落多樣性和組成的影響

侯喜慶,禹桃兵,王培欣,臧華棟,曾昭海,楊亞東

中國農業大學農學院,農業農村部農作制度重點實驗室,北京 100193

華北平原是我國重要的糧食生產基地,集約化的冬小麥-夏玉米種植模式需要投入大量水肥資源來維持作物產量,引發了肥料利用率降低、溫室氣體排放加劇等農業生態環境問題[1]。由于溫室氣體排放的不斷加劇,導致了極端天氣頻發,對農業生產造成了巨大的潛在威脅[2]。同時,農業生產又是環境溫室氣體產生的重要部分,來源于農田的氧化亞氮(N2O)排放約占全球人類活動N2O總排放的50%[3]。農田土壤的N2O排放主要由反硝化作用和硝化作用等途徑產生,且施用氮肥會促進土壤N2O的產生和排放[4—5]。因此,農業生產中溫室氣體減排及其微生物調控成為農業綠色可持續發展和緩解氣候變化的熱點問題。

作為農田管理的重要措施,灌溉[10]、施肥制度[11]和種植制度[12—13]等均會引起氨氧化微生物群落組成和結構的變化。有研究表明,長期施肥增加了AOA群落泉古菌門(Crenarchaeota)和AOB群落硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)的相對豐度[14];而楊亞東等[15]的研究發現增施氮肥僅提高了AOB數量,對AOA數量沒有顯著影響。此外,Song等[16]發現種植模式影響氨氧化微生物群落組成,并且玉米根際土壤中AOB群落組成與蠶豆根際土壤中不同。Wattenburger等[12]發現玉米-大豆輪作土壤的AOB豐度高于其他輪作土壤,并在根際和非根際土壤中發現存在生態位分化現象。因此,不同作物種植歷史及當前作物的根際效應均會對氨氧化微生物群落產生影響,引起氨氧化微生物群落組成和多樣性發生改變。

研究表明,長期豆科作物與禾本科作物輪作不僅能夠提高或維持作物產量,還能提高土壤微生物的群落多樣性[17]。但豆科作物輪作對后茬作物土壤中氨氧化微生物群落的影響及其受后茬作物的根際調控機制尚不清楚。因此,本研究基于豆科作物與冬小麥輪作定位試驗,測定了4種豆禾輪作模式及常規麥玉模式中冬小麥根際和非根際土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落組成和多樣性,為華北平原豆禾輪作種植制度優化及溫室氣體減排提供微生物調控方面的理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

田間定位試驗起始于2016年6月,在河北省滄州市吳橋縣中國農業大學吳橋實驗站基地(37°41′N,116°36′E)進行。該地區位于黑龍港流域中部,屬于暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候,日照充足,年均降雨量562 mm,年均氣溫12.6 ℃,全年積溫(≥0 ℃)為4826 ℃,無霜期為201 d。供試土壤為中壤質潮土,試驗開始前0—20 cm土層土壤基礎養分為:有機質16.09 g/kg,全氮1.02 g/kg,速效磷20.31 mg/kg,速效鉀87.49 mg/kg,土壤pH值為8.0。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區組設計,設置5種輪作種植模式,分別為夏紅小豆-冬小麥(AW)、夏綠豆-冬小麥(MW)、夏花生-冬小麥(PW)、夏大豆-冬小麥(SW)和夏玉米-冬小麥(CW)輪作種植模式,其中CW作為對照。試驗田自建立以來未改變種植模式。每種種植模式3次重復,共15個小區,小區面積為52 m2(8 m × 6.5 m)。

供試作物品種分別為紅小豆“白紅7號”、綠豆“白綠8號”、花生“豫花9719”、大豆“中黃35”、玉米“鄭單958”和小麥“濟麥22”。夏季作物于2018年6月15號播種,玉米采用機械播種,行距60 cm,株距22 cm;豆科作物采用人工播種,行距40 cm,株距15 cm。冬小麥于2018年10月20日播種,行距12 cm,播量為300 kg/hm2。為發揮豆禾輪作模式的氮效應作用,試驗期間所有作物均采用不施肥管理。夏季作物播種前澆底墑水60 mm,生育期不再進行灌溉。冬小麥播種前澆底墑水60 mm,拔節期灌溉60 mm。豆科作物出苗后進行間苗,定期進行中耕除草和病蟲害防治,其他農事管理根據生產實際需求操作。

1.3 土壤樣品采集及土壤理化性質測定

于2019年4月23日冬小麥拔節期采集冬小麥根際和非根際土壤樣品。采用抖土法收集冬小麥根際土壤,每個小區隨機取20—30株冬小麥,整株拔出后輕輕抖動根部,抖落的土壤作為非根際土,隨后用細毛刷將根系表面的土壤掃下來作為根際土。土壤樣品裝于封口袋中,封口時將空氣排凈,迅速放入裝有干冰的保溫箱內帶回實驗室。用無菌鑷子除去碎石和細根等雜物后過2 mm篩,將土壤樣品分成兩部分,一部分自然風干,用于理化性質測定;另一部分放入-80 ℃冰箱保存,用于DNA提取。

土壤理化性質測定參照鮑士旦《土壤農化分析》[18]進行。土壤pH采用電位法測定(土∶水=1∶2.5),土壤有機碳采用重鉻酸鉀容量法測定,全氮采用半微量凱氏定氮法測定,速效磷采用碳酸氫鈉提取法,速效鉀采用原子吸收分光光度法,銨態氮和硝態氮用2 mol/L CaCl2溶液浸提,用流動分析儀測定。

1.4 土壤DNA提取及amoA基因的擴增

用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit For Soil(Omega,美國)試劑盒提取土壤總DNA,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的DNA,并用NANO Quant(Tecan,瑞士)檢測DNA的濃度和純度。選用引物Arch-amoAF(5′-STA ATG GTC TGG CTT AGA CG-3′)/Arch-amoAR(5′-GCG GCC ATC CAT CTG TAT GT-3′)[19]和amoA-1F(5′-GGG GTT TCT ACT GGT GGT-3′)/amoA-2R(5′-CCC CTC KGS AAA GCC TTC TTC-3′)[20]分別擴增AOA和AOB的aomA基因。聚合酶鏈式反應基因擴增(PCR)擴增體系為50 μL:5.0 μL 10 ×ExTaq緩沖液、4.0 μL dNTP、1.0 μL上游引物(10 μM)、1.0 μL下游引物(10 μM)、0.5 μLExTaqDNA聚合酶和2.0 μL DNA模板,最后加ddH2O至50 μL。PCR擴增條件為95 ℃預變性3 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,循環35次。AOA和AOBaomA基因PCR擴增產物用濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其大小和質量。

1.5 高通量測序及序列篩選

用NANO Quant(Tecan,瑞士)測定回收AOA和AOBaomA基因的PCR產物濃度,并將其稀釋至同一濃度。采用Illumina MiSeq測序平臺對AOA和AOBamoA基因進行雙末端測序,由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。用QIIME軟件1.8.0對不同樣本AOA和AOBamoA基因測序的原始序列進行質控篩選,30個樣本AOA和AOBamoA基因測序分別得到1518234和1383621條優化序列。根據標簽和引物序列區分不同處理AOA和AOBamoA基因序列信息,利用UPARSE 7.0軟件在97%相似水平下對操作分類單元(OTU)的代表序列進行聚類分析,利用基于核糖體數據庫項目(RDP)的RDP-classifier貝葉斯算法在功能基因組數資源據庫(FGR)中以97%的相似水平對AOA和AOBamoA基因的OTU代表序列進行注釋。利用MOTHUR軟件1.30.1按最小樣本序列數(保留了在3個樣本中序列數都≥5的OTU和序列數總和≥20的OTU)對各樣本進行抽平分析[21]。經抽平后各樣本分別得到25853條AOAamoA基因序列和29506條AOBamoA基因序列。以Shannon指數(多樣性)、ACE指數和Chao1指數(豐富度)代表氨氧化微生物群落的Alpha多樣性。

1.6 數據分析

對輪作模式和根際效應及其互作效應進行雙因素方差分析,并用Duncan法對根際土和非根際土中不同輪作模式間的土壤理化性質和氨氧化微生物多樣性及組成相對豐度差異顯著性進行檢驗(P<0.05),所用軟件為SPSS 25.0。群落Alpha多樣性圖和群落豐度圖均由Origin 2021完成。利用主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)來分析不同處理微生物群落結構差異及其與土壤理化性質之間的關系,計算和作圖用R 4.1.2中“vegan”包完成。

2 結果與分析

2.1 不同輪作模式冬小麥根際與非根際土壤理化性質

方差分析結果表明(表1),冬小麥根際和非根際土壤的理化性質存在顯著差異,且輪作模式顯著影響土壤理化性質,根際效應對土壤pH、有機碳、速效鉀、銨態氮和硝態氮含量均有極顯著影響(P<0.001)。根際土中,豆禾輪作(AW、MW、PW、SW)顯著增加有機碳和硝態氮含量,但顯著降低土壤pH(P<0.05)。豆禾輪作的土壤有機碳和硝態氮含量分別介于11.48—11.92 g/kg和1.78—3.96 mg/kg之間,而CW模式的有機碳和硝態氮含量分別為9.63 g/kg和0.38 mg/kg。MW模式的土壤速效鉀和銨態氮含量均顯著高于其他模式(P<0.05)。非根際土中,豆禾輪作顯著增加土壤全氮和銨態氮含量,其中MW模式顯著增加速效鉀含量(P<0.05)。

表1 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土壤理化性質

2.2 不同輪作模式冬小麥根際與非根際土壤氨氧化微生物群落Alpha多樣性

方差分析表明(圖1),除AOB群落的Shannon指數外,輪作模式對AOA和AOB群落的Alpha多樣性均有顯著影響(P<0.001),根際效應對AOA和AOB群落的Alpha多樣性均有顯著影響(P<0.05)。對于AOA群落而言(圖1),根際土中,AW模式的Shannon指數最高,比CW模式高8.0%(P<0.05),而AW和MW模式的ACE指數比CW模式分別低11.9%和15.6%(P<0.05),且Chao1指數比CW模式分別低11.2%和16.1%(P<0.05)。非根際土中,Shannon指數與根際土中有相同趨勢,AW模式最高,比MW和CW模式分別高16.4%和4.7%(P<0.05);AW和CW模式的ACE指數分別比MW和PW模式高14.5%—18.9%和11.9%—16.2%(P<0.05);AW和CW模式的Chao1指數比其他3種模式分別高11.7%—19.8%和8.3%—16.1%(P<0.05)。

圖1 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土氨氧化古菌和氨氧化細菌群落的Alpha多樣性

對于AOB群落而言(圖1),根際土中,CW模式的Shannon指數比其他模式高0.1%—5.7%;CW模式的ACE指數比AW、MW、PW和SW模式分別高29.3%、52.6%、16.0%和31.4%(P<0.05);CW模式的Chao1指數比其他模式高23.9%—48.4%,且AW、PW和SW模式的Chao1指數顯著高于MW模式(P<0.05)。非根際土中,AW模式的Shannon指數比MW和PW模式分別高5.9%和6.6%(P<0.05),CW模式的Chao1指數比AW、PW和SW模式分別高15.8%、8.2%和10.0%(P<0.05)。

2.3 不同輪作模式冬小麥根際與非根際土壤氨氧化微生物群落組成

對AOA和AOBamoA基因序列進行OTU聚類分析后分別得到58和52個OTUs。根際土中AW、MW、PW、SW和CW模式分別獲得55、55、55、54和57個AOAamoA基因OTUs以及39、42、43、38和47個AOBamoA基因OTUs;非根際土中AW、MW、PW、SW和CW模式分別獲得56、50、53、56和57個AOAamoA基因OTUs以及39、40、38、40和42個AOBamoA基因OTUs。由圖2所示,不同輪作模式AOA群落的優勢類群主要由OTU57(Norank_Crenarchaeota)、OTU58(Norank_Crenarchaeota)和OTU59(Norank_Crenarchaeota)組成,其相對豐度分別為56.6%、15.4%和4.5%。根際土中,PW模式中AOA群落OTU57的相對豐度比CW模式低15.0%(P<0.05),而AW、MW、PW和SW模式中AOA群落OTU58的相對豐度比CW模式分別高70.2%、68.0%、109.3%和79.9%(P<0.05)。非根際土中,各輪作模式中AOA群落的優勢類群及其相對豐度與根際土中相似,但僅OTU58和OTU5(Norank_Crenarchaeota)的相對豐度在不同輪作模式間存在顯著差異,其中豆禾輪作模式中AOA群落OTU58和OTU5的相對豐度比CW模式分別高57.4%—90.8%和43.4%—134.7%(P<0.05)。

圖2 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土壤氨氧化古菌群落組成

如圖3所示,AOB群落的優勢類群主要由OTU143(Norank_AOB)、OTU139(Norank_AOB)、OTU3(Norank_Nitrosomonadales)、OTU52(Nitrosospira)、OTU56(Norank_Bacteria)、OTU22(Norank_AOB)、OTU95(Norank_Nitrosomonadales)、OTU153(Nitrosospira)和OTU76(Norank_Nitrosomonadales)組成,其相對豐度分別為13.8%、10.3%、8.9%、8.1%、6.5%、6.4%、6.2%、5.8%和4.9%。根際土中,AW模式中AOB群落OTU76的相對豐度比MW和CW模式分別高193.1%和372.1%(P<0.05),MW模式中AOB群落OTU95的相對豐度比SW模式高124.6%(P<0.05)。非根際土中,AW模式中AOB群落OTU76的相對豐度比SW和CW模式分別高192.0%和132.6%(P<0.05),MW模式中AOB群落OTU3的相對豐度比CW模式高161.6%(P<0.05)。

圖3 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土壤氨氧化細菌群落組成

2.4 不同輪作模式冬小麥根際與非根際氨氧化微生物群落Beta多樣性及影響因素

主成分分析(PCA)結果如圖4所示,根際土中主軸1(PC1)和主軸2(PC2)分別解釋了72.1%和15.8%的AOA群落變異,以及34.4%和22.1%的AOB群落變異。非根際土中主軸1和主軸2分別解釋了79.3%和8.8%的AOA群落變異,以及30.1%和20.5%的AOB群落變異?？偟膩砜?不同輪作模式的AOA和AOB群落結構存在差異。其中,根際土中豆禾輪作模式的AOA和AOB群落與CW模式在主軸1和主軸2上有分離,而非根際土中豆禾輪作模式的AOB群落與CW模式在顯著分離現象(P<0.05)。

圖4 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落的主成分分析

圖5 不同輪作模式冬小麥根際和非根際土壤氨氧化古菌和氨氧化細菌群落與環境因子的冗余分析

3 討論

3.1 輪作模式對土壤養分的影響

本研究中,與麥玉輪作相比豆禾輪作增加了冬小麥根際土有機碳和硝態氮含量,但降低了土壤pH值,增加了非根際土全氮和銨態氮含量。有研究表明,將豆科作物摻入連續的禾本科作物輪作系統會增加表層土壤全氮、有機碳等養分含量[22—23]。豆科作物的秸稈C/N比較小,其殘茬中的含氮量較非豆科作物(玉米)高,土壤氮素礦化程度更高,進而引起土壤中全氮含量的增加[22]。作物輪作影響土壤中碳循環過程,進而影響最終的土壤有機物(包括SOC)的形成。這是因為作物殘茬、作物凋落葉以及根系分泌物為土壤提供較高的碳輸入,進而導致有機碳含量的增加[23]。此外,豆科作物與禾本科長期輪作可以防止土壤疏水成分的過度降解,其機理是通過在土壤疏水結構域中摻入較不穩定的有機化合物保護其免受微生物的礦化作用,從而增加有機碳含量[24]。無機氮含量是體現土壤供氮能力大小的有效指標,豆科殘茬能增加土壤無機氮并提高后茬作物的氮利用率[25]。豆禾輪作,尤其是AW和MW模式,土壤中銨態氮和硝態氮含量均高于麥玉輪作,表明其無機氮的比例高于麥玉輪作,這是由于豆科作物的固氮作用導致無機氮的積累、富氮殘留物的礦化以及豆禾輪作過程中土壤累積了更多的礦物結合有機氮(MAOM-N),而MAOM-N是無機氮的重要來源[25—26]。結合來看,豆科作物加入輪作系統在上述情況下是可以增加土壤中養分含量的。

3.2 輪作模式對氨氧化微生物群落Alpha多樣性和組成的影響

輪作模式中不同作物對土壤氨氧化微生物多樣性和組成的影響不同,是由于不同作物的根系形態和根系分泌物有差異。有研究表明,種植玉米和種植大豆的土壤細菌群落有明顯的差異,長期輪作也會導致這種差異[27]。前人利用OTU水平的物種組成來評估微生物群落組成的相對豐度和頻率存在的差異,將其作為微生物群落結構和生理學之間的橋梁[28]。本研究也分析了不同種植模式下氨氧化微生物的OTU組成,發現不同輪作模式下AOA群落中占主導地位的OTUs屬于泉古菌門(Crenarchaeota),AOB群落中占主導地位的OTUs屬于亞硝化單胞菌目(Nitrosomonadales),并且在不同輪作模式下AOA和AOB群落OTUs的相對豐度是波動變化的,少數OTUs的相對豐度在不同輪作模式中表現出顯著差異(圖2和3)。這是由于作物會分泌不同的分泌物,招募了不同的微生物組[29],進而導致了輪作模式間氨氧化微生物群落組成的動態變化。

研究表明,豆科參與輪作系統會顯著提高土壤微生物的多樣性[17]。但在本研究中,豆禾輪作中夏綠豆-冬小麥模式根際和非根際土中AOA群落Alpha多樣性指數均偏低,而其他豆禾輪作模式與夏玉米-冬小麥模式間沒有明顯差異,是因為輪作作物多樣性低或輪作年限較短[30],不同豆科作物輪作模式間雖存在差異,但未體現出顯著趨勢。夏玉米-冬小麥模式中AOB群落ACE指數和Chao1指數高于其他輪作模式,說明夏玉米-冬小麥模式AOB群落多樣性與豆禾輪作模式相似的情況下,其群落豐富度更高。有研究表明,與大豆根際土壤相比,玉米根際土壤有較高的微生物群落多樣性,主要是因為豆科作物根部存在根瘤菌能夠降低細菌的相對豐度[31]。另外,AOA和AOB群落的差異沒有廣泛反映在Shannon多樣性和群落豐富度指標中,是由于這些指標不能完整地體現出微生物群落之間的差異[32]。

3.3 輪作模式對氨氧化微生物群落Beta多樣性的影響

農田中AOA和AOB存在著生態位分化。有研究表明根際和非根際土壤的AOA和AOB群落存在差異,主要是因為作物根系活性和分泌物會造成根際和非根際土壤微環境的差異,進而驅動著土壤微生物群落的組裝和系統發育[40]。本研究結果也表明AOA和AOB群落在根際和非根際土中存在差異,且其群落結構受到不同環境因素的影響。根際土壤中,AOA群落主要受土壤pH和有機碳的影響,而非根際土壤中AOA群落變化受有機碳和全氮驅動,說明在根際和非根際土壤中,每種生態位都有可能的獨特作用[7]。不同輪作模式改變了冬小麥根際土和非根際土壤的有機碳、全氮和土壤pH,而這些因子也是影響AOA和AOB群落的重要因素[41],這進一步表明輪作模式中作物差異可以影響AOA和AOB的群落組成和結構。

4 結論

輪作模式驅動了冬小麥根際和非根際土壤中氨氧化微生物的群落組成及結構變化。豆禾輪作顯著增加氨氧化古菌群落泉古菌門(Crenarchaeota)OTU58的相對豐度,夏紅小豆-冬小麥和夏綠豆-冬小麥模式分別顯著增加氨氧化細菌群落變形菌門(Proteobacteria)OTU76的相對豐度和OTU95、OTU3的相對豐度。根際土壤中土壤pH和有機碳含量增加是導致豆禾輪作模式與麥玉模式氨氧化古菌群落結構發生分離的重要環境驅動因子,而非根際土壤中全氮、銨態氮含量變化是引起豆禾輪作模式與麥玉模式氨氧化細菌群落結構發生分離的主要環境因子。綜上所述,研究結果表明,豆禾輪作種植引起的土壤pH和速效氮含量變化驅動氨氧化古菌和氨氧化細菌群落結構發生演變,且根際與非根際土壤中氨氧化微生物存在生態位分離。