探討宏基因組學第二代測序在肺部感染病原體檢測中的臨床價值

周文清 辛 虹 彭 麗 楊文興 李慧芬 江西省萬載縣人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科 336100

肺部感染作為感染性疾病中發(fā)病率最高的一種,其病原菌的明確極大關系到患者的治療及預后[1],而傳統(tǒng)培養(yǎng)、涂片鏡檢、RT-PCR、特異性抗體測定等方法存在病原體檢出率低、培養(yǎng)周期長等缺陷。因此,在肺部感染病原菌檢測上需要檢出率更高、檢測范圍更廣的方法。宏基因組二代測序技術(Metagenomic next-generation sequencing,mNGS)目前已廣泛、深入地應用于肺部感染領域。在應用mNGS技術診斷肺部感染病原體時,通常會選擇支氣管肺泡灌洗液,與痰液相比,它可以避免口咽菌群的污染,并且敏感性比血液更高[2-3]。本研究評估了mNGS技術在肺部感染患者診斷中的應用價值,并通過病原菌檢出率、檢出種類等方面與常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法進行了比較,旨在為肺部感染患者的病原體診斷增添新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2021年4月—2022年8月我院呼吸與危重癥醫(yī)學科收治的肺部感染患者87例作為觀察對象。納入標準:(1)符合美國胸科協(xié)會關于肺部感染的相關診斷標準;(2)肺部聽診可聞及啰音;(3)病情危重需要盡快明確肺部感染病原體;(4)特殊疾病患者如免疫抑制、合并基礎疾病、反復住院的重癥感染患者等,需要盡快明確肺部感染病原體;(5)傳統(tǒng)微生物檢測技術反復檢測結果均為陰性且治療效果不佳;(6)臨床懷疑為RNA 病毒感染,如流感病毒感染等所致;(7)疑似某種特殊病原體感染;(8)長期發(fā)熱和(或)伴有其他臨床癥狀、病因不明的肺部感染;(9)患者或其家屬簽署檢測研究知情同意書。此處納入標準納入了病情危重患者,而重癥肺炎定義與普通肺炎定義有所區(qū)別。87例患者中,男61例,女26例;年齡17～86歲,平均年齡(56±6.78)歲。

1.2 方法 所選患者均采取了常規(guī)(痰)涂片+培養(yǎng)方法以及mNGS技術進行病原體檢測。(1)標本獲取:對患者行支氣管鏡檢查以及肺泡灌洗術,留取支氣管肺泡灌洗液。(2)常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法:對患者行誘導痰細胞學檢查以及肺泡灌洗液送至本院檢驗科進行涂片、培養(yǎng),檢測病原微生物。(3)mNGS檢測:將采集的標本送至金域醫(yī)學或迪安診斷檢驗中心進行mNGS檢測。嚴格按檢驗中心的標準規(guī)范執(zhí)行標本的采集、運輸、保存等。先通過DNA片段化、修復末端、測序接頭連接以及 PCR 擴增等步驟制備文庫,然后進行上機測序。再進行人工智能化分析,精準識別病原微生物,由權威臨床微生物專家和臨床專家結合長期臨床經驗和全球臨床檢驗標準設定數(shù)據(jù)庫權重基質,結合權重選舉式菌種水平標記法自動快速分析解讀。

1.3 臨床確診 由1位呼吸與危重癥醫(yī)學科主任醫(yī)師、3位主治醫(yī)師、1位影像科主治醫(yī)師、1位檢驗科主治醫(yī)師組成的臨床小組,結合患者血清病原學檢測結果、常規(guī)涂片檢測結果、mNGS結果、胸部CT影像、抗生素療效、臨床癥狀等綜合研判致病病原體。

1.4 檢測指標 本研究主要考察mNGS技術與常規(guī)涂片檢測技術的陽性檢出率、病原體類型、不同類型病原體的檢出情況、以及檢測時長(后文僅僅在討論中可見相關敘述,而本實驗未見相關數(shù)據(jù)以及分析)等

2 結果

87例患者中,經mNGS檢測到病原微生物的有74例,檢出率85.06%;而通過常規(guī)涂片、培養(yǎng)的方法進行檢測,僅有9例檢測到病原微生物,檢出率僅10.34%,顯著低于mNGS檢測方法(P<0.05),詳見表1。

表1 mNGS與常規(guī)檢測方法檢出病原微生物類型、檢出率比較[n(%)]

利用mNGS技術,在87例患者中共檢測到細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體五大類病原微生物,檢出的細菌種類最多(檢出的病原菌中細菌占比最高),有47例患者(54.02%)檢出的病原體屬于細菌,其中25例分屬于4種革蘭氏陽性菌,22例分屬于5種革蘭氏陰性菌。從單個微生物來看,細菌中檢出最多的是結核分枝桿菌,共19例(21.84%)。檢測到了3種真菌,其中煙曲霉占比最高,有8例患者檢測出并被確診為煙曲霉感染。除此之外,檢出的病原微生物中還有5種病毒、1種支原體(肺炎支原體)、1種衣原體(鸚鵡熱衣原體)。

只有9例患者同時能夠利用常規(guī)涂片檢查和mNGS的方法檢出致病病原微生物,均為細菌感染,其中5例結核分枝桿菌、4例銅綠假單胞菌。在真菌和病毒中的檢出率,NGS也大大高于常規(guī)檢查。而在支原體和衣原體的檢測上,兩者的檢出率高于常規(guī)檢測。

3 討論

肺部感染作為呼吸系統(tǒng)中最為常見并且致死率極高的疾病之一,致病原微生物的準確判斷對于疾病的診療至關重要。然而臨床常規(guī)使用的涂片檢查等手段存在一定局限性,并且由于肺部感染的病原菌種類多樣,因此超過2/3的臨床肺部感染疾病無法確診病原微生物,以至于無法精準用藥[4]。mNGS可以通過高通量二代測序技術將樣本中的所有微生物基因進行測序檢測,一次性獲取待檢樣品中可能存在的多種病原體基因組序列。mNGS在肺部感染病原微生物診斷中的應用廣泛,尤其是在病重、反復培養(yǎng)未能找到病原微生物、罕見微生物感染的患者中具有極大優(yōu)勢。本文中,使用mNGS技術的病原微生物檢出率高達85.06%,顯著優(yōu)于檢出率僅10.34%的常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法(P<0.05)。在很多其他研究中,mNGS也表現(xiàn)出更高的檢出率,例如在李殷康等人針對肺部感染患者的研究中,mNGS檢出率為83.33%,而常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測僅有23.33%的[5]。陳婷婷等人的研究結果也顯示類似的結論,mNGS檢出肺部感染陽性率高達72.41%,遠高于血清學檢測(25.86%)或者傳統(tǒng)方法(24.14%)[6]。在檢出的病原微生物類型上,mNGS技術檢測到細菌、真菌、病毒、支原體、衣原體五大類病原微生物。細菌感染是肺部感染中最常見的,本文結果也是如此,檢出的病原微生物中細菌占比最高,達到54.02%。mNGS技術在細菌的檢出率上顯著優(yōu)于常規(guī)涂片檢查(P<0.05)。其中,在革蘭氏陽性菌中,占比最高的是結核分枝桿菌,共檢測到19例(21.84%),在革蘭氏陰性菌中,最多的是銅綠假單胞菌6例(6.90%)。結核分枝桿菌在中國的流行率較高,而銅綠假單胞菌是支氣管擴張癥患者呼吸道標本中最常見的病原菌[7]。常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測到的9例病原微生物也是分布于這兩種細菌。在Li等人的研究中也顯示,在細菌診斷上,mNGS的靈敏度和特異性均高于培養(yǎng)法以及涂片法[8]。在真菌感染的患者中,最多的是煙曲霉感染,而病毒感染患者中鼻病毒較為常見。在細菌和真菌的檢出率比較上,mNGS技術也顯著優(yōu)于常規(guī)涂片+培養(yǎng)檢測(P<0.05)。對于支原體以及衣原體的培養(yǎng),所需的條件苛刻,此外還需要比較恢復期血清學、尿抗原等臨床指標才能進行確診。在本研究中通過mNGS技術檢測出的2例肺炎支原體和2例鸚鵡熱衣原體均無法通過常規(guī)培養(yǎng)檢出。從該結果看,mNGS技術在支原體和衣原體檢測中更具優(yōu)勢,但結果沒有統(tǒng)計學差異,可能由于樣本量較少,因此還需要在未來的研究中擴大樣本范圍以針對具體不同類型病原微生物進行對比得出明確結論。使用常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法檢出率低可能是由于常規(guī)培養(yǎng)基以及一般培養(yǎng)條件下,無法培養(yǎng)出某些特殊種類的病原微生物,例如很多對生長環(huán)境要求苛刻的苛養(yǎng)菌需要在體外培養(yǎng)時加入特殊的營養(yǎng)成分[9]。因此當遇到肺炎鏈球菌、嗜血桿菌屬等病原微生物時,通過常規(guī)培養(yǎng)通常無法顯示陽性結果。而mNGS技術無須對微生物進行培養(yǎng),因此不受培養(yǎng)環(huán)境的限制,通過對核酸進行高通量測序,就可以分析樣本中的微生物種類及豐度信息[10]。除此之外,mNGS受抗生素暴露的影響也更小。時效性對于肺部感染疾病的治療很關鍵,在更早期就能明確病原菌,從而針對性治療,能夠有效控制感染,防止疾病進一步進展。在本文中,mNGS技術檢測的樣本從送檢至出結果不超過48h,而利用常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法通常需要耗時3～4d時間才能獲得培養(yǎng)結果,而結核分枝桿菌檢出時間更是長達2～8周,此外還經常出現(xiàn)培養(yǎng)病原菌陰性的情況[5]。因此從及時治療的角度來看,mNGS技術更有優(yōu)勢,能夠盡早明確病原菌,從而進行針對性治療。在常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法檢出的病原菌陰性后,再考慮使用mNGS技術再次檢測,則可能會對疾病最佳治療有所影響。雖然隨著mNGS技術的不斷成熟與發(fā)展,目前的檢測費用與剛問世時相比已明顯降低,在臨床上的普及性推廣,大多數(shù)患者能接受。常規(guī)涂片+培養(yǎng)方法目前仍然是不可或缺的重要病原微生物檢測手段,在此基礎上,根據(jù)患者病情、經濟情況等因素綜合考量應用mNGS技術以提高檢測效率,盡早明確病原微生物并進行針對性治療。