葛仙米酶解工藝優化及復合調味素的研制

盧玉翠 馮盈盈 黃晴霞 高鑫 趙立春 廖夏云

摘要：對葛仙米進行酶解工藝優化并制作一款以葛仙米為主要原料的復合調味素。利用單因素試驗和正交試驗，以氨基酸態氮含量為指標，感官評價和美德拉反應綜合分析結果表明，最佳酶解工藝條件為胰蛋白酶濃度9%、時間2 h、溫度50 ℃，此條件下氨基酸態氮含量為0.713 g/100 g；葛仙米美拉德反應最佳條件為葛仙米質量分數25%、反應時間75 min、反應溫度70 ℃、100 g葛仙米液中葡萄糖添加量5 g，此條件下葛仙米液的味道最佳；葛仙米復合調味素的最佳配方為葛仙米液40 g、食鹽3 g、蔗糖3 g、鮮味劑4 g、香菇汁3 g、玉米變性淀粉10 g。該試驗研制了一款顆粒大小均勻、淡黃色、滋味鮮美的葛仙米復合調味素，為葛仙米的綜合開發利用提供了一定的理論基礎。

關鍵詞：葛仙米；氨基酸態氮；酶解；美拉德反應；復合調味素

中圖分類號：TS264.9????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）12-0111-06

Optimization of Enzymatic Hydrolysis Process of Nostoc sphaeroides Kütz.

and Development of Compound Seasoning Elements

LU Yu-cui1， FENG Ying-ying1， HUANG Qing-xia1，

GAO Xin1， ZHAO Li-chun2*， LIAO Xia-yun1，2*

（1.School of Pharmacy， Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530021， China; 2.Guangxi

Key Laboratory of Medicine and Food Homologous Resources Development， Guangxi Zhuang

Yao Medicine Engineering Technology Research Center， Nanning 530021， China）

Abstract： The enzymatic hydrolysis process of Nostoc sphaeroides Kütz. is optimized and a compound seasoning element is prepared with Nostoc sphaeroides Kütz. as the main raw material. Using single factor test and orthogonal test， with the content of amino acid nitrogen as the index， the results of sensory evaluation and comprehensive analysis of Maillard reaction show that the optimal enzymatic hydrolysis process conditions are trypsin concentration of 9%， time of 2 h and temperature of 50 ℃. Under such conditions， the content of amino acid nitrogen is 0.713 g/100 g. The optimal Maillard reaction conditions of Nostoc sphaeroides Kütz. are as follows： Nostoc sphaeroides Kütz. mass fraction of 25%， reaction time of 75 min， reaction temperature of 70 ℃， and glucose addition amount of 100 g Nostoc sphaeroides Kütz. solution is 5 g. Under such conditions， the taste of Nostoc sphaeroides Kütz. solution is the best. The optimal formula of the compound seasoning elements is 40 g Nostoc sphaeroides Kütz. solution， 3 g salt， 3 g sucrose， 4 g flavor enhancer， 3 g Lentinus edodes juice and 10 g modified corn starch. In this test， a delicious and light yellow Nostoc sphaeroides Kütz. compound seasoning element with uniform particle size is developed， which has provided a certain theoretical basis for the future comprehensive development and utilization of Nostoc sphaeroides Kütz..

Key words： Nostoc sphaeroides Kütz.; amino acid nitrogen; enzymatic hydrolysis; Maillard reaction; compound seasoning element

葛仙米（Nostoc sphaeroides Kütz.）又稱天仙米、田木耳，為單細胞絲狀藍藻，是一種藥食兼用的珍貴食品[1-2]。根據記載，葛仙米具有益氣明目、解熱、清膈、利腸胃、久食延年、消除疲勞、收斂、治夜盲癥等功效[3]，現代研究表明，葛仙米蛋白具有較好的調節免疫、抗炎、抗氧化、抗紫外損傷、抗腫瘤等功能[4-5]。葛仙米含有多種營養成分，如粗蛋白48.61%、粗脂肪8.11%、碳水化合物12.69%、粗灰分5.50%等[6]。近年來，人工培養技術已趨于完善，葛仙米越來越多地被運用于食品[7]、保健品[8]和化妝品[9]中。《本草綱目》記載：“葛仙米，出勾漏草澤間；采得曝干，仍漬以水，可作羹入饌，味甚鮮；初取時如小鮮木耳，紫綠色，以醋拌之，肥脆可食，干則以水浸之，與肉同煮，作木真味”。葛仙米既是傳統中藥，又可以作為營養價值較高的調味素原材料。

葛仙米有兩層細胞壁，內層由果膠和纖維素組成，外層的膠質化學成分主要是果膠和多糖。葛仙米常富鈣，是因為在一定條件下多糖容易氧化成糖酸，從而容易與金屬離子結合而富集金屬，并且多糖具有大量羥基，較易形成氫鍵，導致在膠質鞘的層理中有石灰質的沉淀。葛仙米的這一細胞結構限制了對其營養物質的吸收利用，只有使其破壁，營養物質才能得以釋放而得到充分利用[10]。目前，多采用超聲輔助法[11]、反復凍融法[12]、酶法[13]、高壓均質法[14]和球磨法[15]等對藻類進行破壁。

本研究以葛仙米為原料，經酶解工藝優化和美拉德等一系列反應，制備一款葛仙米復合調味素，賦予其鮮美的風味和營養價值，以期為葛仙米的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

考馬斯亮藍G250（分析級）：上海現代制藥股份有限公司；牛血清白蛋白（分析級）：北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（食品級）：南寧龐博生物工程有限公司；I+G（呈味核苷酸二鈉）：河南萬邦實業有限公司。

JY92-IIN型超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技有限公司；UV-2600i型紫外可見分光光度計 日本島津公司；SPX-250A生化培養箱 上海煜南儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葛仙米液的制備

將清洗干凈的葛仙米鮮品加入PBS緩沖液中，在料液比為1∶50（g/mL）的條件下，超聲功率500 W，40 ℃超聲30 min，隨后將樣品溶液在凍融時間4 h、凍融溫度－20 ℃的條件下反復凍融處理3次，過濾，向濾液中加入胰蛋白酶酶解，高溫滅酶15 min，冷卻，4 000 r/min離心15 min，上清液即為葛仙米液，備用。

1.2.1.1 ?氨基酸態氮含量測定

參照黎瑞珍等[16]的方法測定氨基酸態氮含量。以光密度值為縱坐標，氮的質量（μg）為橫坐標，擬合得到回歸方程y=0.010 5x+0.606 8，R2=0.997 1，取葛仙米液1.0 mL至100 mL容量瓶中，加水定容，吸取2.0 mL按同樣操作得到待測樣品溶液，將得到的光密度值代入回歸方程，通過計算得到樣品中氨基酸態氮含量（g/100 g）。

1.2.1.2 酶解單因素試驗

試驗考察酶用量、酶解時間、酶解溫度3個因素對葛仙米氨基酸態氮含量的影響。各因素梯度分別為酶用量3%、5%、7%、9%、11%；酶解時間0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；酶解溫度35，40，45，50，55 ℃。

1.2.1.3 酶解正交試驗

以單因素試驗結果為基礎，以氨基酸態氮含量為指標，進行L9（33）正交試驗。因素A胰蛋白酶用量為5%、7%、9%，因素B酶解時間為1.5，2.0，2.5 h，因素C酶解溫度為45，50，55 ℃。

1.2.2 葛仙米復合調味素研制工藝

葛仙米液進行美拉德反應→葛仙米美拉德液感官評價→混合輔料濃縮制軟材→制粒→干燥（使含水率在1%以下）→包裝→對葛仙米復合調味素進行感官檢驗。

1.2.2.1 感官評定標準

選擇10位感官人員對成品進行打分，結果取平均值。葛仙米美拉德液感官評分標準為氣味（30分）：香氣自然清新，23～30分；香氣微弱，幾近沒有，15～22分；無明顯香氣，＜15分。滋味（30分）：滋味鮮美純正，23～30分；滋味不明顯，15～22分；無滋味且略有腥味，＜15分。口感（40分）：口感濃郁豐厚，入口細膩，26～40分；口感濃郁，入口感覺一般，10～25分；鮮味不明顯，略有焦糊味，＜10分。葛仙米復合調味素感官評分標準為滋味（30分）：滋味鮮美純正，23～30分；滋味不明顯，幾近沒有，15～22分；無滋味且略有腥味，＜15分。顏色（30分）：淡黃色，23～30分；黃色，15～22分；深黃色或白色，＜15分。形態（40分）：形狀均勻完整，26～40分；形狀完整，但有較大顆粒或較多細粉，10～25分；形狀不完整，細粉和大顆粒較多，＜10分。

1.2.2.2 葛仙米美拉德液單因素試驗

試驗考察了葛仙米液質量分數、溫度、時間、葡萄糖添加量4個因素對葛仙米美拉德液感官品質的影響。各因素梯度分別為葛仙米液質量分數10%、15%、20%、25%、30%；溫度50，60，70，80，90 ℃；時間30，60，90，120，150 min；100 g葛仙米液的葡萄糖添加量3，4，5，6，7 g。

1.2.2.3 葛仙米美拉德液正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以感官評分為指標，進行四因素四水平正交試驗。因素D葛仙米液質量分數為22.5%、25%、27.5%，因素E溫度為65，70，75 ℃，因素F時間為75，90，105 min，因素G葡萄糖添加量為4.5，5.0，5.5 g。

1.2.2.4 葛仙米復合調味素配方

a.單因素試驗

試驗以感官評分為指標，考察食鹽添加量、蔗糖添加量、鮮味劑（味精∶I+G為20∶1）添加量、香菇汁添加量4個因素對葛仙米復合調味素品質的影響，各因素梯度分別為食鹽添加量1，2，3，4，5 g；蔗糖添加量1，2，3，4，5 g；鮮味劑添加量1，2，3，4，5 g；香菇汁添加量1，2，3，4，5 g。

b.正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以食鹽、蔗糖、鮮味劑（味精∶I+G為20∶1）、香菇汁添加量作為考察因素，進行四因素四水平正交試驗。因素H食鹽添加量為2.5，3.0，3.5 g，因素I蔗糖添加量為2.5，3.0，3.5 g，因素J鮮味劑添加量為3.5，4.0，4.5 g，因素K香菇汁添加量為2.5，3.0，3.5 g。

1.2.3 數據處理

使用SPSS、Excel、Origin 2018等軟件進行相關圖表的繪制和數據處理，平行測定3次，結果取平均值。

2 結果與分析

2.1 葛仙米酶解工藝結果

2.1.1 酶用量、酶解時間、酶解溫度對葛仙米氨基酸態氮含量的影響

氨基酸態氮含量與酶用量呈正相關，當酶用量超過7%時葛仙米氨基酸態氮含量基本不變，可能是因為底物已經充分酶解，酶的作用效果不顯著，氨基酸態氮含量不再隨著酶用量的增加而升高，說明適當的酶添加量可使酶解產物具有更好的生物活性。該結果與劉鵬莉等[17]采用蛋白酶對扇貝裙邊進行酶解，其蛋白酶添加量的變化情況一致。綜合考慮，胰蛋白酶用量為7%最適用于葛仙米的酶解。隨著酶解時間的延長，氨基酸態氮含量逐漸增加，酶解2 h后，氨基酸態氮含量減少，說明酶解時間過長會造成營養成分損失，不利于酶解[18]，因此，胰蛋白酶的最佳酶解時間為2 h。在酶解溫度35～50 ℃時氨基酸態氮含量隨著溫度的升高而升高，而50 ℃后出汁率與酶解溫度呈負相關。當溫度高于50 ℃后，酶分子結構發生變化，酶的生物活性被破壞，無法發揮作用[19]，導致氨基酸態氮含量反而下降，同時結合工業生產和成本控制來看，選擇胰蛋白酶的最佳酶解溫度為45 ℃。

2.1.2 酶解工藝正交試驗結果

由極差分析可知影響因素主次順序為RA＞RB＞RC，即酶用量對葛仙米氨基酸態氮含量的影響最大，其次是酶解時間，酶解溫度的影響最小。胰蛋白酶最優酶解條件為酶解溫度50 ℃、酶解時間2 h、酶用量9%，在該條件下進行驗證試驗，試驗結果為葛仙米氨基酸態氮含量0.713 g/100 g，大于其他組合的最大氨基酸態氮含量，由方差分析結果可知，在顯著性水平α=0.05下，因素A酶用量和因素B酶解時間影響顯著，因素C酶解溫度影響不顯著，本試驗結果與杜小琴等[20]的結果相似。

2.2 葛仙米復合調味素研制工藝結果

2.2.1 不同葛仙米液質量分數、反應溫度、反應時間、葡萄糖添加量對美拉德反應感官評分的影響

由圖1中a可知，隨著葛仙米液質量分數的增加，美拉德反應程度提升，產生了口感獨特的物質，感官評分上升；質量分數超過25%，感官評分略有下降。在美拉德反應過程中，隨著葛仙米液質量分數的增加，具有獨特香味、口感的葛仙米液賦予美拉德反應產物良好的口感，同時過量的葛仙米液在反應過程中可能造成口感稍差，影響美拉德反應產物的整體口感，使感官評分降低，最終確定葛仙米液質量分數為25%。由圖1中b可知，反應溫度是影響美拉德反應的重要因素，隨著溫度的升高，葛仙米液的香味及口感也會提高，而且較高的溫度有利于產生大量香味，當反應溫度超過70 ℃時，會產生較強烈的異味；溫度過低，反應不充分，香氣不夠濃郁[21]，因此，最終確定反應溫度為70 ℃。由圖1中c可知，當反應時間增加到90 min時，隨著反應時間的延長，葛仙米液不斷反應，產生一系列風味物質，使得感官評分升高，而反應時間超過90 min后，反應產物中會產生少量焦糊的氣味[22]，使得感官評分降低，最終確定反應時間為90 min。由圖1中d可知，隨著葡萄糖添加量的增加，美拉德反應程度提高，產生了更多的香味物質，感官評分上升；添加量超過5 g時，感官評分明顯下降。在美拉德反應過程中，隨著葡萄糖添加量的增加，具有香味的小分子物質不斷生成，賦予美拉德反應產物良好的風味，達到反應平衡后反應速率降低，同時過量的葡萄糖在反應過程中可能生成了具有不良氣味的大分子物質，會影響美拉德反應產物的整體風味，使感官評分降低，最終確定葡萄糖添加量為5 g。

2.2.2 葛仙米美德拉液正交試驗結果

由正交試驗結果可知，各因素對葛仙米美拉德反應液綜合評分影響的因素主次順序為RD＞RG＞RE＞RF，即葛仙米液質量分數對美拉德反應感官評分的影響最大，其次是葡萄糖添加量和反應溫度，而反應時間對美拉德反應感官評分的影響最小。最佳的美拉德反應條件為葛仙米液質量分數25%、反應溫度70 ℃、反應時間75 min、葡萄糖添加量5 g，此時感官評分為94.3分。在最佳條件下進行3次平行試驗，并對美拉德反應液進行感官分析，最后得到一款鮮味獨特、口味良好、口感醇厚、香氣清新的葛仙米液。

2.2.3 不同食鹽添加量、蔗糖添加量、鮮味劑添加量、香菇汁添加量對葛仙米復合調味素感官評分的影響

由圖2中a可知，食鹽添加量會影響葛仙米復合調味素的風味，含量過高則會過于酸澀而使得消費者難以接受，含量過低則使葛仙米復合調味素只有甜味，風味單一，缺乏回味，恰當的酸味才會使葛仙米復合調味素更具有風味[23]，因此，當食鹽添加量為3 g時感官評分最高，為83.2分，此時葛仙米復合調味素酸味適中，風味令人滿意。由圖2中b可知，不同蔗糖添加量之間的感官評分差異不明顯，蔗糖添加量為3 g時感官評分最高，恰當地使用蔗糖，能確保葛仙米復合調味素應有的味道和質量，不僅能提高甜味，而且可抑制酸味，使得調味素口味和諧[24]。由圖2中c可知，隨著鮮味劑添加量的增加，感官評分明顯提高，但添加量超過4 g后，感官評分下降，鮮味劑可以補充或增加葛仙米復合調味素原有的風味物質，但添加過多會影響口感[25]，因此，最佳鮮味劑添加量為4 g。由圖2中d可知，香菇味道鮮美，香氣沁人，營養豐富，隨著香菇汁添加量的增加，感官評分顯著提高，添加量超過3 g后，感官評分驟降，可能是因為過多的香菇汁影響了葛仙米復合調味素的風味[26]，因此，最佳香菇汁添加量為3 g。

2.2.4 葛仙米復合調味素配方正交試驗結果

由正交試驗結果可知，4個因素對葛仙米美拉德反應液綜合評分影響的主次順序為RJ＞RK＞RH＞RI，即鮮味劑添加量＞香菇汁添加量＞食鹽添加量＞蔗糖添加量，獲得的最佳美拉德反應條件為鮮味劑添加量4 g、食鹽添加量3 g、蔗糖添加量3 g、香菇汁添加量3 g，此時感官評分為95.5分。在最佳條件下進行3次平行試驗，并對葛仙米復合調味素進行感官分析，最后得到顆粒均勻、淡黃色、味道鮮美的葛仙米復合調味素。

2.2.5 葛仙米復合調味素干燥工藝結果

在本研究中發現制成的葛仙米復合調味素在貯存過程中有少許吸濕性，為了進一步優化產品，從效率和環保經濟的角度考慮，選擇45 ℃真空干燥30 min，該條件能降低葛仙米復合調味素的水分含量，使含水率在1%以下。

2.2.6 理化指標檢測結果

由圖3可知，葛仙米復合調味素呈均一顆粒狀，淡黃色，形態均勻，不粘連，久置無潮解現象。

2.2.7 微生物檢測結果

最優產品按照國家標準進行檢測，參照GB 10133－2014《食品安全國家標準 水產調味品》對菌落總數及大腸菌群的要求，未檢測出菌落總數及大腸菌群，符合衛生要求。

3 結論

本研究探討了葛仙米酶解工藝優化及復合調味素的研制，結果表明，葛仙米最佳酶解工藝條件為胰蛋白酶用量9%、酶解時間2 h、酶解溫度50 ℃，此條件下氨基酸態氮含量為0.713 g/100 g。葛仙米美拉德反應最佳條件為葛仙米液質量分數25%、反應時間75 min、反應溫度70 ℃、100 g葛仙米液中葡萄糖添加量5 g，此條件下葛仙米液的味道最佳；葛仙米復合調味素最佳配方為葛仙米液40 g、食鹽3 g、蔗糖3 g、鮮味劑4 g、香菇汁3 g、玉米變性淀粉10 g，水浴加熱混合均勻后干燥，取出的物料呈揉之成團、觸之易散的狀態，將物料過篩制粒后于45 ℃真空干燥30 min，成品的理化指標和微生物檢測結果均符合國家標準，得到一款顆粒大小均勻、淡黃色、滋味鮮美的葛仙米復合調味素。

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收稿日期：2023-07-03

基金項目：國家青年岐黃學者項目（2020-7）；國家自然科學基金項目（82160775）

作者簡介：盧玉翠（1996-），女，碩士研究生，研究方向：中藥化學。

*通信作者：趙立春（1980-），男，研究員，博士，研究方向：藥食同源產品的研究與開發；

廖夏云（1985-），女，瑤族，副教授，博士，研究方向：保健食品的研究與開發。