蕎麥麩皮蛋白的制備及功能特性研究

王立博 陳靜 任艷娟 閆銘歡 張亞坤 王昊然 吳偉菁 羅登林

摘要：探究了蕎麥麩皮蛋白的最佳制備工藝及功能特性差異。通過單因素實驗對pH、溫度、料液比和時間進行初步優化，并在此基礎上采用響應面實驗確定最佳工藝參數：pH為10，料液比為1∶10，時間為60 min，溫度為40 ℃。進一步分析了溫度和pH對苦蕎麩皮蛋白和甜蕎麩皮蛋白功能特性的影響。結果表明，隨著溫度升高，兩種蛋白的溶解性及持水性均呈上升趨勢，在60～80 ℃時，兩種蛋白有較好的起泡性和乳化性，且穩定性良好。堿性環境（pH≥8）可提高兩種蛋白質的溶解性、持水性、乳化性和乳化穩定性。與大豆分離蛋白相比，極酸（pH=2）或堿性（pH≥8）條件下，甜蕎麩皮蛋白展現出良好的起泡性，而苦蕎麩皮蛋白則展現出良好的泡沫穩定性。綜上所述，適當熱處理及堿性環境可改善蕎麥麩皮蛋白的功能特性。

關鍵詞：蕎麥麩皮；蛋白；單因素實驗；響應面法；功能特性

中圖分類號：TS201.21????? 文獻標志碼：A???? 文章編號：1000-9973（2023）12-0016-09

Preparation and Functional Properties of Buckwheat Bran Protein

WANG Li-bo1， CHEN Jing1， REN Yan-juan1， YAN Ming-huan1， ZHANG Ya-kun2，

WANG Hao-ran3， WU Wei-jing4， LUO Deng-lin1*

（1.College of Food and Bioengineering， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471023，

China; 2.College of Agricultural Equipment Engineering， Henan University of Science and

Technology， Luoyang 471023， China; 3.College of Food Science and Engineering，

Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China; 4.Department of

Public Health and Medical Technology， Xiamen Medical College，

Xiamen 361023， China）

Abstract： The optimal preparation process and functional property differences of buckwheat bran protein are investigated. The pH， temperature， solid-liquid ratio and time are preliminarily optimized by single factor experiment. On this basis， response surface experiment is used to determine the optimal process parameters： pH is 10， solid-liquid ratio is 1∶10， time is 60 min and temperature is 40 ℃. The effects of temperature and pH on the functional properties of tartary buckwheat bran protein and common buckwheat bran protein are further analyzed. The results show that the solubility and water holding capacity of tartary buckwheat bran protein and common buckwheat bran protein both increase with the increase of temperature.At 60～80 ℃， the foaming and emulsification properties of tartary buckwheat bran protein and common buckwheat bran protein are good and the stability is also good. The alkaline environment （pH≥8） can improve the solubility， water holding capacity， emulsification property and emulsification stability of tartary buckwheat bran protein and common buckwheat bran protein. Compared with soybean isolated protein， the foaming

property of common buckwheat bran protein is good under very acidic （pH=2） or alkaline （pH≥8） conditions， while the foam stability of tartary buckwheat bran protein is good. In summary， appropriate heat treatment and alkaline environment can improve the functional properties of buckwheat bran protein.

Key words： buckwheat bran; protein; single factor experiment; response surface method; functional properties

蕎麥與小麥、大米等谷物具有相似的化學和利用特性，隸屬于蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum）雙子葉植物，常被歸類為一種“偽谷物”[1]。甜蕎（F. esculentum Moench）和苦蕎（F. tataricum （L.） Gaertn.）是常用于農業種植的2個重要蕎麥品種[2]，兩者所含成分相似，富含淀粉、蛋白質、膳食纖維、黃酮類、多酚和維生素等功能物質[3-4]。這些功能物質賦予兩者良好的加工特性及獨特的藥用價值。近年來，關于蕎麥用于開發功能性食品的價值已被廣大研究者所證實，而現有的關于蕎麥在食品中的應用研究多是以籽?；蛉鄣男问絹磉M行復配應用，例如粥、面條、面包、饅頭、餅干、茶[5-7]，而基于蕎麥各功能組分的相關應用研究鮮有報道。

蕎麥蛋白營養均衡且氨基酸種類豐富，尤其是在蕎麥麩皮中蛋白含量約為12%～24%，其中含有8種人體必需的氨基酸。其中，賴氨酸含量比大米和小麥多2倍以上[8-9]。研究表明，經常食用蕎麥或蕎麥制品可以預防“賴氨酸缺乏癥”，實現人體營養均衡[10]。因此，蕎麥可作為一種比一般谷物更優越的蛋白質來源[11]。但由于蕎麥自身的無麩質特性，這也決定了蕎麥麩皮蛋白在食品加工和應用中的局限性[12]。考慮到苦蕎麩皮中黃酮類、多酚等物質的含量較高以及對蛋白提取潛在的影響，本實驗以苦蕎麩皮為代表，結合單因素實驗和響應面實驗進行蕎麥麩皮蛋白的提取工藝優化研究。在此基礎上，探究苦蕎麩皮蛋白（tartary buckwheat bran protein，TBBP）和甜蕎麩皮蛋白（common buckwheat bran protein，CBBP）在不同pH和溫度條件下功能特性的變化規律，以期為蕎麥蛋白在功能食品中的進一步研究和應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎麩皮（黑豐1號）：山西雁門清高食業有限責任公司；甜蕎麩皮（榆林紅花）：定邊縣塞雪糧油工貿有限責任公司；大豆分離蛋白（分散型，soybean isolate protein，SPI）：河南省鯤華生物技術有限公司。

1.2 試劑

考馬斯亮藍G250：上海藍季科技發展有限公司；十二烷基磺酸鈉：天津市光復精細化工研究所；氫氧化鈉、鹽酸、石油醚、無水乙醇（均為分析純）：天津市德恩化學試劑有限公司。

1.3 儀器與設備

UNIC UV-2100紫外分光光度計 廣州瑞豐實驗設備有限公司；TDZ5-WS離心機 湖南湘儀離心機儀器有限公司；FE20 pH計 武漢德盟科技有限公司；LGJ-10D冷凍干燥機 北京四環起航科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 TBBP的制備

以苦蕎麩皮粉為原料，按1∶10（質量與體積比）加入75%乙醇，用保鮮膜封口，常溫下250 r/min電動水浴攪拌40 min，以去除類黃酮、色素等物質，經4 500 r/min離心10 min，收集沉淀，上述步驟重復5次。按1∶10（質量與體積比）在沉淀中加入石油醚，用保鮮膜封口并置于通風櫥浸泡脫脂12 h，經75%乙醇洗滌3次后放入50 ℃烘箱中干燥4 h備用[13]。

將經處理的苦蕎麩皮粉與蒸餾水按一定比例混合均勻，滴加1 mol/L NaOH溶液調節pH，于不同溫度下200 r/min水浴攪拌一定時間，經4 500 r/min離心20 min后，收集上清液滴加1 mol/L HCl溶液至pH為4.2，經4 000 r/min離心15 min后富集沉淀，用蒸餾水沖洗2～3次，將沉淀按1∶3（質量與體積比）于蒸餾水中溶解，用1 mol/L NaOH溶液調pH至中性，真空冷凍干燥后，即得TBBP[12]。

1.4.2 TBBP提取工藝參數單因素實驗

考慮到影響TBBP得率的主要因素為pH、溫度、料液比和時間，以pH 9、溫度35 ℃、料液比1∶10、時間60 min為固定值分析各因素變化對蛋白質得率的影響。各因素設置：pH為8，8.5，9，9.5，10；溫度為25，30，35，40，45 ℃；料液比為1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14（質量與體積比）；時間為20，40，60，80，100 min。以TBBP得率（干重）為響應值，按照上述設置進行單因素實驗。

蛋白質得率（%）=提取得到粗蛋白質量（干重）脫脂苦蕎麩皮質量（干重）×100%。

1.4.3 響應面法優化TBBP的提取條件

采用四因素三水平的Box-Behnken實驗，考察pH、溫度、料液比和時間對TBBP得率的影響。各因素水平設置見表1。

1.4.4 蛋白質功能特性的測定

基于上述最優工藝制備TBBP和CBBP，并以大豆分離蛋白為參照，考察不同溫度（20，40，60，80，100 ℃）及pH （2，4，6，8，10）對制備的TBBP和CBBP溶解性、持水性、起泡性以及乳化性的影響。

1.4.4.1 溶解性的測定

量取20 mL不同溫度和pH的蛋白質溶液（1%，質量與體積比），室溫下2 000 r/min渦旋30 s，4 500 r/min離心15 min，之后用紫外分光光度計在595 nm處測定上清液中蛋白質的含量[14]。

溶解性（%）=上清液中蛋白質含量樣品中總蛋白含量×100%。

1.4.4.2 持水性的測定

稱取0.5 g蛋白樣品粉末（干重）置于離心管中，與不同溫度和pH下制備的0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液混合制成1%的蛋白質溶液，并以500 r/min磁力攪拌至溶解，經4 500 r/min離心10 min后，棄去上清液，稱量離心管和沉淀總重[15]。

持水性（%）=m3-m2m1×100%。

式中：m1為樣品質量，g；m2為離心管和樣品總重，g；m3為離心管和沉淀總重，g。

1.4.4.3 起泡性及泡沫穩定性的測定

量取一定體積（V1）不同溫度和pH條件下制備的蛋白質溶液（1%，質量與體積比）于50 mL試管中，10 000 r/min均質1 min，立即記錄溶液的體積（V2）。室溫靜置30 min后，記錄體積（V3）[16]。

起泡性（%）=V2-V1V1×100%，

泡沫穩定性（%）=V2-V3V2-V1×100%。

式中：V1為原始體積，mL；V2為0 min時溶液和泡沫的總體積，mL；V3為30 min時溶液和泡沫的總體積，mL。

1.4.4.4 乳化性及乳化穩定性的測定

準確量取12 mL不同溫度和pH條件下制備的蛋白質溶液（1%，質量與體積比）于100 mL離心管中，加入4 mL大豆油，在10 000 r/min條件下均質1 min，立即從離心管的底部吸取20 μL溶液并與5 mL 0.1%（質量與體積比）SDS溶液混勻，在500 nm處測定吸光度值。30 min后繼續取樣測定吸光度，計算乳化穩定性[17]。

乳化性（m2/g）=2×2.303×A0×Nc×L×θ×10，

乳化穩定性（min）=30×A0A0-At。

式中：A0為0 min時測得的吸光度；At為30 min時測得的吸光度；N為稀釋因子，N=100；c為蛋白質樣品濃度，g/mL；θ為乳化液中油相的比例，θ=0.25；L為孔板體積，L=0.01 m-2。

1.5 數據處理

采用SPSS 26.0及Origin 2021進行數據的分析與繪圖；采用Design-Expert 13.0進行響應面分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 TBBP提取的單因素實驗結果分析

由圖1中A可知，隨著pH的增加，TBBP得率呈現先下降后上升的趨勢，在pH為8.5時，蛋白質得率最低，為19.33%。當pH＞8.5時，隨著pH的增加，TBBP得率有明顯的上升，并且在pH為9.5時達到拐點（P<0.05），為20.74%。當pH過高時，蛋白質易發生變性，其加工性質及營養價值均會降低，考慮到后續蛋白功能特性需要，確定pH值為9.5。

由圖1中B可知，當溫度逐漸升高時，蛋白質得率呈現階梯式上升趨勢；當溫度為25～30 ℃時，蛋白質得率無顯著變化。當溫度達到35 ℃時蛋白質得率最高（P<0.05），為20.43%；當溫度大于35 ℃時，蛋白質得率處于穩定狀態（P>0.05），因此確定最佳溫度為35 ℃。

由圖1中C可知，TBBP得率隨著料液比的增加呈現先上升后緩慢下降的趨勢，當料液比小于1∶8時，蛋白質得率無顯著變化。當料液比為1∶10時蛋白質得率達到最大值（P<0.05），為20.41%，之后隨著料液比的增加，TBBP得率緩慢降低，但無顯著差異，因此確定最佳料液比為1∶10。

由圖1中D可知，當時間為20～40 min時，蛋白質得率顯著增加（P<0.05），當時間為40 min時達到最大值，為20.39%；當時間大于40 min時，蛋白質得率先降后升，但無顯著差異，為提高提取效率和節約資源，確定最佳時間為40 min。

2.2 響應面法優化實驗設計及結果分析

2.2.1 響應面實驗設計與結果

根據單因素實驗結果，選擇pH（9.5）、溫度（35 ℃）、料液比（1∶10）和時間（40 min）為影響因素，以蛋白質得率為響應值，進行四因素三水平的響應面實驗，具體實驗方案見表1，響應面實驗結果見表2。以TBBP得率為指標，使用Design-Expert 13.0軟件對自變量進行二次多元線性回歸分析，得到回歸方程：Y=-0.620 716+0.344 960A-0.962 104B+6.972 83C- 0.347 200D+0.143 780AB-0.207 075AC-0.005 493AD-0.050 270BC+0.009 190BD+0.003 363CD-0.071 657A2-0.004 715B2-0.156 897C2+0.000 842D2。

2.2.2 響應面模型的方差分析

對回歸模型進行檢驗，方差分析結果見表3。

由表3可知，該模型的F值為24.88，具有重要意義，P<0.000 1，表明該回歸模型極顯著；失擬項的P值為0.562 3>0.05，模型的相關系數R2=0.961 4，調整系數RAdj2=0.922 7，表明該響應面模型的擬合程度較好，可用于TBBP最佳工藝條件的分析與預測[18-19]。由F值的大小可知各因素對蛋白質得率的影響程度為pH（A）>料液比（C）>時間（D）>溫度（B）。

2.2.3 各因素之間的交互作用

由圖2中A1和A2可知，隨著pH的增加，TBBP得率也隨之逐漸增加，而隨著溫度的升高，蛋白質得率呈緩慢下降的趨勢。等高線圖顯示，沿pH的等高線比較密集，說明pH對蛋白質得率的影響更顯著。而等高線圖部分彎曲，表明pH和溫度兩個因素存在交互作用且影響顯著（P<0.05）。由圖2中B1和B2可知，隨著料液比的增加，蛋白質得率顯著升高（P<0.05）。等高線顯示，沿料液比等高線比較密集，因此料液比對蛋白質得率的影響比溫度顯著。等高線呈橢圓形，表明料液比和溫度兩個因素的交互作用高度顯著（P<0.01）[20]。由圖2中C1和C2可知，隨著溫度的升高，蛋白質得率顯著下降（P<0.05），而時間的變化對蛋白質得率無顯著影響。等高線圖顯示，沿時間方向等高線比較密集，表明時間對蛋白質得率的影響顯著。而等高線呈馬鞍形，表明時間和溫度兩個因素的交互作用較強，影響極顯著（P<0.001）[21]。

2.2.4 響應面優化及驗證實驗

通過回歸模型分析，確定最佳工藝條件：pH為9.92，溫度為38.48 ℃，料液比為1∶9.53，時間為58.42 min，預測蛋白質得率為22.76%。為方便實驗操作，將工藝參數調整為pH 10、溫度40 ℃、料液比1∶10、時間60 min，在此條件下進行驗證實驗，TBBP得率為（22.09±0.37）%，CBBP得率為（22.34±0.45）%，與最佳條件下預測值接近，證明該優化實驗結果可靠，模型適用于蛋白質的提取。

2.3 蛋白質功能特性結果與分析

在響應面優化最佳工藝條件下制備TBBP和CBBP，以SPI為參照，考察不同溫度及pH對蛋白質功能特性的影響。

2.3.1 蛋白質溶解性結果與分析

由圖3中A可知，隨著溫度的升高，TBBP和CBBP的溶解性整體呈增加的趨勢，在100 ℃時達到最大溶解性，分別為30.27%和48.95%，而SPI在60 ℃時的溶解性最大，為32.71%，而溫度過高或者過低，SPI的溶解性顯著降低。表明高熱處理對TBBP和CBBP的影響小于SPI，不易導致蕎麥蛋白的過度聚集，致使蛋白質的溶解性降低。

由圖3中B可知，當pH在蛋白質等電點附近（pH=4.2）時，SPI、TBBP和CBBP的溶解性均達到最低值，分別為4.77%、6.78%和3.49%，這一特性與大多谷物蛋白相似，如燕麥蛋白[22]。而當pH>4時，蛋白質的溶解性均顯著增強，其中，TBBP和CBBP的溶解性較相近，且顯著高于SPI，這是因為當pH遠離等電點時，蕎麥蛋白分子的電荷和靜電排斥力會增加，從而促使蛋白質與水分子結合，進而展現出較高的溶解性[23]。

2.3.2 蛋白質持水性結果與分析

不同溫度和pH對蛋白質持水性的影響見圖4。

由圖4中A可知，3種蛋白在100 ℃時持水性均達到最大值。其中SPI的持水性增加最劇烈（從3.62%增加至21.84%），而在60 ℃時，TBBP和CBBP的持水性呈階梯式增加，分別從2.66%和7.74%增加到3.92%和12.81%。這是由于隨著溫度升高，分子熱運動更加劇烈，使水分子在蛋白質體系中的分布更加均勻，促使蛋白質與水結合的速度加快。此外，高溫處理亦會使包裹在球狀蛋白質分子內部的極性側鏈發生解離，轉向蛋白質分子表面，從而提高了蛋白質的持水性[24]。

由圖4中B可知，SPI的持水性隨著pH的增加呈先降低后升高的趨勢，而TBBP和CBBP的持水性在pH<4時無顯著差異，之后隨著pH的增加呈上升趨勢，這是因為隨著pH值遠離等電點，蛋白質與水分子間的結合能力逐漸增強。其中，TBBP和CBBP的持水性遠低于SPI，這歸因于它們的表面疏水性差異。當pH=4時，SPI、TBBP和CBBP的持水能力相近且均為最小值，分別為5.58%、4.25%和4.89%，這一現象與紫蘇籽粕蛋白的報道相似[25]，這是由于在等電點附近時，蛋白質分子之間不存在靜電斥力，分子間引力增強，促進蛋白質分子間的相互結合，導致蛋白質與水分子的結合能力減弱。

2.3.3 蛋白質起泡性和泡沫穩定性結果與分析

由圖5中A和C可知，隨著溫度的升高，SPI的起泡性顯著增加，在100 ℃時起泡性達到最大值（43.54%），其泡沫穩定性在60 ℃時達到最大值，為65.71%。隨著溫度升高，CBBP和TBBP的起泡性及泡沫穩定性整體呈現先上升后下降的趨勢，起泡性分別在60 ℃和80 ℃時最高，為69.73%和48.67%。當溫度低于60 ℃時，CBBP的起泡性遠高于其余兩種蛋白，這是因為溫度較低時，蛋白質分子間運動減緩，蛋白質的黏度增加，因而表現出良好的起泡性[26]。當溫度升高時（>60 ℃），蛋白質的黏度下降，因而TBBP和CBBP溶液的起泡性及泡沫穩定性均顯著下降。

由圖5中B和D可知，蛋白質溶液的起泡性及泡沫穩定性隨著pH的增加均呈先下降后上升的趨勢。當pH在2～4時，SPI、TBBP和CBBP的起泡性顯著降低（分別從54.15%、38.90%和90.80%降低至19.07%、12.95%和17.77%），而當pH>4時，蛋白質溶液的起泡性均顯著升高。這是因為只有蛋白質的可溶性部分參與泡沫的形成，因此在等電點附近（pH=4.2）蛋白質的起泡性能減弱，極酸或堿性條件下蛋白質的溶解性增大，而使得蛋白質溶液的起泡性能增強并逐漸趨于平穩[27]。其中，CBBP的起泡性升高最顯著，而TBBP的泡沫穩定性則高于其余兩種蛋白。因此，與SPI相比，極酸（pH=2）或堿性（pH≥8）條件下，CBBP展現出良好的起泡性（>91%），但泡沫穩定性欠佳（<9%）；而TBBP的起泡性較差（<39%），但泡沫穩定性較好（>69%）。

2.3.4 蛋白質乳化性和乳化穩定性結果與分析

由圖6中A和C可知，隨著溫度的升高，3種蛋白質的乳化性均呈現先升高后降低的趨勢。SPI和CBBP的乳化性波動顯著，兩者在80 ℃時乳化性最高，分別為8.41 m2/g和8.86 m2/g，而TBBP的乳化性在60 ℃時最高，為4.76 m2/g。這可能是因為適當的加熱可以使蛋白質結構舒展，暴露出更多的疏水基團，提高蛋白質分子的柔軟性和表面疏水能力，使得蛋白質更容易吸附到油-水界面，從而使蛋白質的乳化性提高[24]。隨著溫度繼續升高，蛋白質的乳化性均顯著下降，并且TBBP和CBBP表現出較低的乳化性，這是因為高溫導致蛋白質發生變性而聚集，使蛋白質分子的疏水性與親水性的比值減小，從而影響蛋白質的乳化性[28]。

由圖6中B和D可知，蛋白質的乳化性及乳化穩定性在pH為4時均達最低值，此時SPI、TBBP和CBBP的乳化性分別為1.77，2.17，0.88 m2/g。當pH為6～8時，TBBP和CBBP的乳化性及乳化穩定性顯著升高，并且CBBP的乳化性及乳化穩定性顯著高于其他兩種蛋白，這與pH對蛋白質的溶解性影響規律基本一致（見圖3中B），即在接近等電點時，蛋白質分子表面的正負電荷數量基本相同，分子間作用力較小，乳化微粒間相互碰撞發生聚集沉淀，導致蛋白質的乳化性降低[29]。當pH遠離蛋白質等電點后，氨基酸側鏈發生解離，產生靜電排斥力，避免了蛋白質的聚集，從而表現出良好的乳化性和乳化穩定性[30]。

3 結論

本實驗采用堿提酸沉的方法從蕎麥麩皮中提取蛋白質，先通過單因素實驗對TBBP的提取條件進行初步優化，在此基礎上進行四因素三水平的響應面實驗，確定提取的最優工藝參數：pH為10，料液比為1∶10，時間為60 min，溫度為40 ℃，在此條件下TBBP的得率為（22.09±0.37）%，CBBP得率為（22.34±0.45）%，接近預測值，表明提取工藝條件可靠，可用于蛋白質的提取。

在此工藝條件下制備TBBP和CBBP，并探究不同溫度及pH對兩種蛋白功能特性的影響。結果發現，隨著溫度的升高，兩種蛋白的溶解性及持水性均呈現增加趨勢，在60～80 ℃時，兩種蛋白展現出較好的起泡性和乳化性，且穩定性較好。過高的溫度會導致蛋白質聚集，黏度下降，從而使得兩者的起泡性和乳化性降低。當pH在等電點附近時（pH=4.2），蛋白質的溶解性、持水性、起泡性及泡沫穩定性、乳化性及乳化穩定性均最低。堿性環境（pH≥8）可提高蛋白質的溶解性、持水性、乳化性和乳化穩定性。與SPI相比，極酸（pH=2）或堿性（pH≥8）條件下，CBBP展現出良好的起泡性（>91%），但泡沫穩定性欠佳（<9%），而TBBP的起泡性較差（<39%），但泡沫穩定性較好（>69%）。綜上所述，適當的加熱處理及堿性環境可改善TBBP和CBBP的功能特性，后續可針對蕎麥蛋白展現的功能特性差異進行深層次研究。

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收稿日期：2023-06-24

基金項目：國家自然科學基金青年基金項目（32202096）；河南省重點研發與推廣專項（科技攻關）（232102110159）；教育部產學合作協同育人項目（220503880205011）；河南省重大公益專項（201300110300）；河南科技大學博士科研啟動基金（13480082）

作者簡介：王立博（1988—），男，講師，博士，研究方向：谷物科學與利用。

*通信作者：羅登林（1976—），男，教授，博士，研究方向：食品營養與健康。