Tob1通過誘導(dǎo)自噬抑制腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13增殖促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

李小亮 倫瑞花

1 河南省焦作市第二人民醫(yī)院 454001; 2 焦作市婦幼保健院

腎上腺皮質(zhì)癌(Adrenocortical carcinoma,ACC)是一種罕見的發(fā)生于腎上腺皮質(zhì)的惡性腫瘤,侵襲性強(qiáng)并易發(fā)生轉(zhuǎn)移,患者的5年生存率僅有5%～10%[1]。目前,該腫瘤的治療方法有手術(shù)、放療、化療以及分子靶向治療[2]。其中,分子靶向治療作為一種新型方法在ACC的治療中顯現(xiàn)出了巨大的潛力。尋找新的治療靶點,探索其分子機(jī)制,在ACC的治療中具有重要意義。

Tob1(Transducer of ErbB2.1)是細(xì)胞異位基因ErbB2轉(zhuǎn)錄因子抗增殖蛋白家族成員,在乳腺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種癌癥中發(fā)揮腫瘤抑制的作用[3-4]。最新在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)Tob1對細(xì)胞自噬有誘導(dǎo)作用[5]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)Tob1在腎上腺皮質(zhì)癌患者中表達(dá)偏低,但其影響ACC的具體分子機(jī)制尚未明確。本研究擬探討Tob1在腎上腺皮質(zhì)癌中對細(xì)胞自噬的作用,以明確Tob1對ACC腫瘤抑制作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞株SW-13購于美國模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection,ATCC);胎牛血清、DMEM、F12培養(yǎng)基購于美國Gibco公司;載體pcDNA3.1購于美國Invitrogen公司;3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine,3-MA)購于美國Sigma公司;PCR引物購于上海生工生物工程有限公司;蛋白一抗和二抗購于美國Abcam公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組處理:SW-13細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM/F12(1∶1)培養(yǎng)基中,置于37 °C,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3d傳代一次,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)?？蛰d質(zhì)粒(pcDNA3.1)或Tob1過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-Tob1)采用LipofectamineTM3000試劑轉(zhuǎn)染SW-13細(xì)胞。細(xì)胞分為3組:對照組(control),正常培養(yǎng)的SW-13細(xì)胞;空載質(zhì)粒對照組(pcDNA3.1),SW-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pcDNA3.1;pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(pcDNA3.1-Tob1),SW-13細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pcDNA3.1-Tob1。后續(xù)自噬抑制劑處理組(pcDNA3.1-Tob1+3-MA),在pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的SW-13細(xì)胞中加入5mmol/L的自噬抑制劑3-MA處理。

1.2.2 實時熒光定量PCR:采用TRIzol試劑提取各組SW-13細(xì)胞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成模板cDNA。采用SYBR Green進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系(20μl)為9μl SYBR Green Mix,2μl上游引物,2μl下游引物和dd H2O。反應(yīng)條件為95℃ 10min;95℃ 15s,54℃ 10s,72℃ 30s,30個循環(huán);最后在72℃下延伸5min。引物信息如下:Tob1上游引物5’-CTTCAGGAGGTGTTCAC-3’,下游引物5’-AACCTTTACCACTGCCACTT-3’;GAPDH上游引物5’-AGCCACATCGCTGAGACA-3’,下游引物5’-GCCCAATACGACCAAATCC-3’。以GAPDH 為內(nèi)參基因,用 2-ΔΔCt計算 Tob1 mRNA 表達(dá)量。

1.2.3 Western blot檢測蛋白表達(dá):采用RIPA細(xì)胞蛋白裂解液裂解各組SW-13細(xì)胞,提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA試劑盒測定蛋白濃度。同等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后,進(jìn)行電轉(zhuǎn)膜,隨后用5%脫脂奶粉室溫封閉2h。加入Tob1、LC3、Beclin-1、p62和GAPDH蛋白一抗在4℃孵育過夜,漂洗后加入二抗室溫孵育1h。滴加ECL化學(xué)發(fā)光液,凝膠成像分析系統(tǒng)成像,結(jié)果采用ImageJ圖像處理軟件分析,以GAPDH為內(nèi)參,檢測目的蛋白相對表達(dá)水平。

1.2.4 LC3免疫熒光檢測:在各組SW-13細(xì)胞中加入多聚甲醛固定15min。加入5% 牛血清蛋白后室溫封閉1h,按說明加入稀釋的LC3蛋白一抗 4℃過夜,隨后加入二抗室溫孵育1h。最后在熒光顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的熒光狀況。

1.2.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖:在各組SW-13細(xì)胞中加入將CCK-8試劑與細(xì)胞培養(yǎng)基以1∶10混合形成的培養(yǎng)液,37°C孵育4h,用酶標(biāo)儀在490nm波長處測量吸光值(A值),計算細(xì)胞增殖率。

1.2.6 Tunel檢測細(xì)胞凋亡:在待測SW-13細(xì)胞加入4%多聚甲醛固定30min。隨后加入50μl Tunel反應(yīng)混合液避光孵育1h,PBS漂洗后再加入50μl DAPI反應(yīng)15min。最后置于熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)采用 Graphpad Prism 7.01統(tǒng)計軟件分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差(one-way ANOVA)分析及Bonferroni檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13后Tob1表達(dá)顯著上調(diào) 采用Tob1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人腎上腺皮質(zhì)癌SW-13細(xì)胞,qRT-PCR和western blot結(jié)果如圖1所示,與control組相比,Tob1的mRNA和蛋白表達(dá)在pcDNA3.1-Tob1組中上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細(xì)胞中Tob1表達(dá)的影響

2.2 pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染影響人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13中自噬蛋白的表達(dá) 如圖2所示,與對照組相比,pcDNA3.1-Tob1組中LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)顯著下降,LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)顯著提升,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。同時pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著下調(diào)SW-13細(xì)胞中p62的表達(dá),上調(diào)Beclin1的蛋白表達(dá)(P<0.05)。

圖2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細(xì)胞中自噬蛋白表達(dá)的影響

2.3 pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染促進(jìn)人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13自噬 LC3免疫熒光檢測SW-13細(xì)胞自噬水平,結(jié)果如圖3所示,control組中綠色熒光斑點較少,而在pcDNA3.1-Tob1組中能觀看到明顯的綠色熒光斑點聚集,表明pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著上調(diào)了SW-13細(xì)胞自噬水平。

圖3 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Tob1對SW-13細(xì)胞自噬的影響

2.4 Tob1通過促進(jìn)自噬抑制人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13增殖 采用自噬抑制劑3-MA處理pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染的SW-13細(xì)胞。如圖4所示,pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著抑制SW-13細(xì)胞增殖。同時與pcDNA3.1-Tob1組相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA組細(xì)胞增殖明顯提升(P<0.05)。

圖4 3-MA對pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染的SW-13細(xì)胞增殖的影響

2.5 Tob1通過促進(jìn)自噬提升人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13凋亡 如圖5所示,pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染顯著提升SW-13細(xì)胞凋亡。與pcDNA3.1-Tob1組相比,pcDNA3.1-Tob1+3-MA組細(xì)胞凋亡下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 3-MA對pcDNA3.1-Tob1轉(zhuǎn)染的SW-13細(xì)胞凋亡的影響

3 討論

腎上腺皮質(zhì)癌作為一種內(nèi)分泌型惡性腫瘤,進(jìn)展快,病死率高[6]。探索腎上腺皮質(zhì)癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制、研發(fā)新型治療方式是該疾病的防治工作重點。隨著對腫瘤生物學(xué)行為認(rèn)識的不斷深入,細(xì)胞死亡在包括腎上腺皮質(zhì)癌在內(nèi)多種癌癥中的作用越來越受到研究者重視[7-8]。細(xì)胞自噬是程序性細(xì)胞死亡的一種,通過溶酶體吞噬細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等造成細(xì)胞死亡,該過程廣泛存在于多種疾病的病理進(jìn)程中,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮重要作用[9-10]。已有研究顯示,在腎上腺皮質(zhì)癌中低表達(dá)的抑癌基因Tob1在胃癌中能激活細(xì)胞自噬[5]。據(jù)此,筆者通過轉(zhuǎn)染含有Tob1的表達(dá)載體pcDNA3.1-Tob1至人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13,探討Tob1在SW-13細(xì)胞中對自噬的作用以及對人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的影響。

本研究首先對轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-Tob1的SW-13細(xì)胞中的Tob1表達(dá)進(jìn)行測定,結(jié)果表明與正常SW-13相比,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒的細(xì)胞中Tob1的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著提升,表明該質(zhì)粒能在SW-13細(xì)胞中有效過表達(dá)Tob1。LC3是檢測自噬活性的標(biāo)志性蛋白。自噬過程中胞質(zhì)內(nèi)的Ⅰ型LC3蛋白在經(jīng)過泛素樣加工修飾后,結(jié)合磷脂酰乙醇胺形成脂溶性的Ⅱ型LC3蛋白,進(jìn)而參與自噬泡膜的延伸,并促進(jìn)自噬體的成熟[11]。銜接蛋白p62可與LC3相互結(jié)合,轉(zhuǎn)染至自噬體后降解,與自噬的活性呈負(fù)相關(guān)[12]。Beclin 1是自噬調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子之一,可招募自噬相關(guān)蛋白促進(jìn)自噬前體形成[13]。本研究結(jié)果顯示,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1在Tob1過表達(dá)的SW-13細(xì)胞中顯著上調(diào),p62蛋白表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步通過免疫熒光法檢測得出Tob1過表達(dá)顯著提升SW-13細(xì)胞的自噬水平,與在胃癌中結(jié)果一致。

3-MA是一種經(jīng)典的自噬抑制劑,能夠通過抑制Class PI3K-Ⅲ,阻止自噬體的形成,進(jìn)而抑制細(xì)胞內(nèi)自噬的發(fā)生[14]。為了研究Tob1對自噬的促進(jìn)作用對人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞的影響,筆者在Tob1過表達(dá)的SW-13細(xì)胞中加入自噬抑制劑3-MA處理。本研究結(jié)果顯示,Tob1的過表達(dá)顯著抑制了SW-13的細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,與筆者前期在人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞H295R中的結(jié)果相一致。同時與pcDNA3.1-Tob1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比,3-MA的加入提升了SW-13細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,表明Tob1在SW-13細(xì)胞中發(fā)揮的抑癌基因作用是通過激活自噬產(chǎn)生的。

綜上所述,Tob1可通過激活細(xì)胞自噬抑制人腎上腺皮質(zhì)癌細(xì)胞SW-13的細(xì)胞增殖,并促進(jìn)其凋亡,為Tob1作為分子靶標(biāo)應(yīng)用于人腎上腺皮質(zhì)癌的治療提供了理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。