氨糖軟骨素鈣片安全性毒理學試驗研究

殷光玲，賢 歡，肖義然，黃遠英

（湯臣倍健股份有限公司營養健康研究院，廣東 廣州 510700）

氨糖軟骨素鈣片是一種以氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、骨碎補、CaCO3和酪蛋白磷酸肽（Casein Phosphopeptide，CPP）為主要原料的保健食品，具有增加骨密度的作用。本產品所添加的5 個主要原料均有相關研究證明其在增加骨密度方面的作用。氨基葡萄糖是關節軟骨組織的主要成分之一，外源性補充氨基葡萄糖可促進軟骨膠原合成，維持關節軟骨結構的完整性，促進鈣沉積，增強骨密度[1]。已有動物試驗證明氨基葡萄糖可逆轉骨量的丟失，改善骨質疏松[2]。硫酸軟骨素是一種糖胺聚糖，是結締組織的成分之一，大量文獻報道了其對骨關節炎的改善作用[3-4]。有研究表明，硫酸軟骨素和氨基葡萄糖聯用，對于骨質疏松的預防和治療具有協同增效作用[5]。骨碎補是藥典記載的一種根莖類中藥，屬水龍骨科，國內外已有較多研究表明其可有效抑制骨質流失、加速骨骼傷患的康復，骨碎補黃酮是主要的功效物質[6]。鈣是人體骨骼的主要成分，確保體內血鈣的正常水平對于防治骨質疏松癥尤為重要[7-8]。而CPP 作為一種牛乳水解活性肽，由于其分子結構中含有持鈣能力較強的陰離子簇，可促進人體對鈣離子的吸收。動物試驗表明，CPP 與鈣同時攝入，可提高體內血清和股骨鈣水平，增強骨密度[9-11]。已有較多研究報道了氨糖軟骨素鈣片中各主要功能原料的功效性，而對于幾種功能原料組成的復合物的安全性，尚無相關文獻報道。本研究以氨糖軟骨素鈣片為受試物，通過動物試驗評估，獲取系統的安全性數據。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

氨糖軟骨素鈣片：由湯臣倍健股份有限公司提供，人體口服劑量為0.069 g·（kg bw）-1。取樣品用粉碎機粉碎成粉末后進行試驗。

1.2 試驗動物

SPF 級昆明種小鼠和SD 大鼠：長沙市天勤生物技術有限公司，試驗動物生產許可證號SCXK（湘）2014-001。

1.3 儀器與試劑

SYSMEX XT-2000i 全自動血球計數儀，日本希森美康；BECKMAN COULTER AU 680 全自動生化分析儀，美國貝克曼庫爾特；METTLER TOLEDOAB204-N 分析天平，梅特勒托利多；疊氮鈉（NaN3），Ruibio；2-氨基茐、9-茐酮，Aladdin；絲裂霉素C（Mitomycin C，MMC），購自Roche；1,8-二羥基蒽酮，Sigma；S9 混合液，上海齊源生物；環磷酰胺，上海瑞永生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 小鼠急性經口毒性試驗

參照GB 1519.3—2014[12]，采用最大耐受劑量法進行急性毒性試驗，選用小鼠作為試驗動物，以羧甲基纖維素水溶液作為受試物溶劑，受試液濃度為50%，單次灌胃劑量為20.0 g·（kg bw）-1。灌胃后14 d 內，監測小鼠生長狀態。

1.4.2 Ames 試驗

參照GB 15193.4—2014[13]，用于測試的菌株為鼠傷寒沙門氏菌TA97a、TA98、TA100、TA102。設溶劑對照組（二甲亞砜）、陽性對照組、自發回變組和受試樣不同劑量組（8 μg/皿、40 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿、5 000 μg/皿）。其中不同組別中陽性對照設置內容：TA97a+S9、TA98+S9、TA100+S9 的陽性對照為2-AF（10.0 μg/皿）；TA97a-S9、TA98-S9組陽性對照為9-芴酮（0.2 μg/皿）；TA100-S9 組陽性對照為NaN3（1.5 μg/皿）；TA102+S9 組陽性對照為1,8-二羥蒽醌（50.0 μg/皿）；TA102-S9 組陽性對照為MCC（0.5 μg/皿）。

若回變菌落數是自發回變組的2 倍及以上，并呈現劑量效應，則判斷為陽性結果。

1.4.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

參照GB 15193.5—2014[14]，經口灌胃，采用30 h給受試物法。受試小鼠隨機分為5組，設陽性對照組（環磷酰胺）、陰性對照組（1%羧甲基纖維素）和受試樣不同劑量組[低劑量組2.5 g·（kg bw）-1、中劑量組5.0 g·（kg bw）-1、高劑量組10.0 g·（kg bw）-1]，每組10 只。給藥結束后處死小鼠，取胸骨制成細胞懸液涂片。觀察并計算含微核嗜多染紅細胞（Polychromatic Erythrocytes，PCE）千分率和嗜多染紅細胞占總紅細胞的比值（PCE/NCE）。

1.4.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗

參照GB 15193.8—2014[15]，進行小鼠精母細胞致畸試驗，受試動物小鼠隨機分為5 組，每組5 只。灌胃劑量同1.4.3，連續灌胃5 d，每天1 次。給藥結束后第14 天將小鼠處死，取附睪涂片，伊紅染色，觀察并計算精原細胞染色體畸變發生率。

1.4.5 30 d 喂養試驗

參照GB 15193.22—2014[16]，取SD 大鼠80 只，隨機分為4 組，即對照組（基礎飼料）和低、中、高劑量組[分別為1.72 g·（kg bw）-1、3.45 g·（kg bw）-1、6.90 g·（kg bw）-1]，每組20 只。低、中、高3 個劑量組分別按1.72%、3.45%、6.90%的比例添加樣品，周期為30 d。

試驗期間試驗動物自由飲水和攝食，記錄攝食量和體重增長情況，以及其他行為表現。給藥結束，采集大鼠血樣，進行血常規和生化指標檢測。采血后頸椎脫臼處死試驗大鼠進行大體解剖，稱量各主要臟器質量，計算相對重量（臟/體比值），同時進行組織病理切片觀察。

2 結果與分析

2.1 小鼠急性經口毒性試驗

由表1 可知，試驗小鼠以受試樣品進行單次大劑量（20.0 g·kg-1）灌胃后，2 周內的體重增長未受影響，未出現死亡或中毒反應等現象。試驗動物處死后，進行解剖檢查，各主要臟器均未發現病變。故氨糖軟骨素鈣片對試驗小鼠的最大耐受劑量大于20.0 g·（kg bw）-1，根據GB 15193.3—2014 中的分級標準，屬無毒級。

表1 小鼠經口急性毒性試驗結果表

2.2 Ames 試驗

由表2 可知，對于4 株菌株，陽性對照組中回變菌落數均在自發回變組2 倍以上，呈現陽性結果；而受試樣不同劑量組（8～5 000 μg/皿）中，無論是否加S9 溶液，樣品給藥組回變菌落數均低于自發回變組的2 倍，未出現陽性結果。

表2 樣品Ames 試驗結果表（）

表2 樣品Ames 試驗結果表（）

2.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

由表3 可知，與對照相比，受試樣品給藥組微核率無顯著差異（P＞0.05），而陽性對照組（環磷酰胺）則出現了顯著升高的現象（P＜0.05）。同樣，與陰性對照相比，各組PCE/NCE比值也并無顯著差異。此結果表明，受試樣品組小鼠骨髓細胞的有絲分裂正常，染色體并未出現損傷，未出現異常毒性反應。

表3 小鼠骨髓微核發生率表

2.4 小鼠精原細胞染色體畸變試驗

由表4 可知，與陰性對照相比，不同劑量受試樣品組的小鼠精原細胞染色體畸變發生率無顯著性差異（P＞0.05），而陽性對照（環磷酰胺）的畸變率與對照組相比，則出現了顯著升高的現象（P＜0.05）。該結果表明，受試樣品對于試驗雄鼠的精子無毒性作用，即未發現遺傳毒性。

表4 小鼠精原細胞染色體畸變發生率表

2.5 30 d 喂養試驗

2.5.1 受試樣品對大鼠攝食情況和體重的影響

由表5 可知，喂養期間，不同劑量受試樣品組雌、雄鼠的攝食量、體重增長量和食物利用率，與對照組相比，均沒有顯著性差異（P＞0.05）。受試樣品組大鼠的生長狀態無異常，未出現死亡現象，依據所記錄動物的行為表現和精神狀態，未出現明顯中毒反應。

表5 試驗大鼠總食物利用率表（）

表5 試驗大鼠總食物利用率表（）

2.5.2 樣品對大鼠血常規和生化指標的影響

大鼠30 d 喂養試驗結束時，不同劑量受試樣品組的雌、雄大鼠與對照組相比，血常規各項指標（紅細胞、白細胞、淋巴細胞等）均無顯著性差異（P＞0.05），見表6。同樣，與對照組大鼠相比，不同劑量受試樣品組大鼠的生化指標（谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、膽固醇、甘油三酯、尿素氮、肌酐和血糖指標等），也均無顯著性差異（P＞0.05），見表7。結果表明，氨糖軟骨素鈣片給藥后，試驗大鼠的血液學細胞計數、肝腎功能等體征均未出現異常，生化指標上未表現出毒性反應。

表6 大鼠30 d 喂養試驗末期血液學檢查結果表（x-±s）

表7 大鼠30 d 喂養試驗末期生化指標檢查結果表（）

表7 大鼠30 d 喂養試驗末期生化指標檢查結果表（）

2.5.3 解剖及組織病理結果

30 d喂養結束后，對大鼠進行解剖，各主要臟器（肺部、心臟、脾臟、肝腎、生殖器官等）組織形態未出現肉眼可見的異常病態。高劑量組雌性大鼠和雄性大鼠的肝、脾、腎、胃、腸、睪丸（卵巢）均未見明顯與試驗因素有關的病理組織學變化。綜上所述，以氨糖軟骨素鈣片為受試物進行的30 d 喂養試驗表明，喂養期間，試驗動物的生長情況未出現異常，機體狀態良好（攝食與增重、生化和血常規、主要臟器絕對和相對重量等）。組織病理檢查未發現明顯有關的異常改變，表明氨糖軟骨素鈣片無明顯毒副作用。

3 結論

人體試驗表明，氨基葡萄糖可有效治療膝骨關節炎，顯著降低患者的疼痛程度，且具有良好的安全性和耐受性[17]。硫酸軟骨素在國內外也被用作治療骨關節炎的對癥藥物，其長期安全性臨床試驗中尚未報告任何明顯的副作用[18]。氨基葡萄糖與硫酸軟骨素聯用，可有效緩解骨關節炎患者的疼痛感，且具有良好的耐受性[19]。骨碎補總黃酮已作為一種藥品，被應用于骨質疏松癥的治療，對改善患者的骨密度具有一定的輔助治療作用，且具有良好的安全性[20]，尚未報道有嚴重的藥物不良反應，僅少數病例報道了腸道不適等輕微副作用[21]。但此前尚無研究報道氨基葡萄糖、硫酸軟骨素、骨碎補、CaCO3和CPP 復合物的安全性，本試驗首次研究了由此5 種功能原料，經科學配比復配制備的復合物的安全性。研究結果表明，本受試物以20.0 g·kg-1劑量單次給小鼠灌胃后，未出現毒副作用表現，最大耐受劑量大于20.0 g·kg-1。根據GB 15193.3—2014 的分級標準，屬無毒級。Ames 試驗、哺乳動物紅細胞微核試驗、精原細胞染色體畸變試驗均表明無致突變作用；30 d 喂養期間，試驗動物生長情況無異常，未出現中毒癥狀和死亡現象，表明氨糖軟骨素鈣片具有長期食用安全性。本次毒理學試驗結果表明，氨糖軟骨素鈣片作為一款保健食品，具備良好的安全性。