高效液相色譜-電霧式檢測(cè)器法測(cè)定益母草中鹽酸水蘇堿

盧柏林，馬恩耀,2，周勁松,2，孫心恒，謝珊珊

（1.廣東漢潮中藥科技有限公司，廣東 廣州 510360；2.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510360）

益母草屬于唇形科植物，具有活血消腫、調(diào)經(jīng)利尿、清熱解毒等多種功效，常作為治療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)經(jīng)閉、惡露不盡、水腫尿少和瘡瘍腫毒等癥狀的主治藥物[1]。益母草中的主要化學(xué)成分包括生物堿類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、二萜類(lèi)、苯丙醇苷類(lèi)、黃酮類(lèi)和香豆素類(lèi)等，同時(shí)含有鐵、錳、鋅、鉛等多種微量元素。生物堿類(lèi)中的益母草堿及鹽酸水蘇堿屬于益母草的重要活性成分[2-3]，因此是益母草質(zhì)量控制重點(diǎn)關(guān)注的成分。

在2020 年版《中國(guó)藥典》中，首次在通則0512“高效液相色譜法”的高效液相色譜儀檢測(cè)器中補(bǔ)充了電霧式檢測(cè)器（Charged Aerosol Detector，CAD）。CAD 是基于霧化-氣溶膠的檢測(cè)器，其檢測(cè)原理是將液相洗脫液霧化蒸發(fā)后檢測(cè)溶質(zhì)顆粒的帶電粒子的信號(hào)流，具有靈敏度高、重復(fù)性好、不依賴(lài)于化學(xué)結(jié)構(gòu)信號(hào)響應(yīng)一致性、動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍寬、操作直觀簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，適用于分析各種不揮發(fā)或半揮發(fā)性化合物[4]。中藥中含有大量糖類(lèi)及苷類(lèi)等紫外吸收弱的成分，因此電霧式檢測(cè)器在中藥分析研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛[5-8]。

蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（Evaporative Light Scattering Detector，ELSD）屬于通用型檢測(cè)器，是擴(kuò)充高效液相色譜檢測(cè)范圍的重要檢測(cè)器之一。因此，對(duì)于類(lèi)似益母草中鹽酸水蘇堿等無(wú)紫外吸收成分的含量測(cè)定，現(xiàn)多采用高效液相色譜儀（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）搭配ELSD 檢測(cè)器的方法進(jìn)行檢測(cè)。但ELSD 檢測(cè)器本身存在線(xiàn)性范圍較窄、基線(xiàn)噪音偏大、影響因素較多等缺點(diǎn)。在《中國(guó)藥典》益母草項(xiàng)下鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法中，供試品中鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰前容易有干擾峰，分離度較差，需要在要求范圍內(nèi)更改流動(dòng)相比例或柱溫、流速等才能把目標(biāo)峰與干擾峰分離，從而達(dá)到準(zhǔn)確定量的效果，但相對(duì)會(huì)影響效率。因此，本次試驗(yàn)將用CAD 檢測(cè)器代替ELSD 檢測(cè)器對(duì)益母草中鹽酸水蘇堿進(jìn)行測(cè)定，以準(zhǔn)確定量和提高效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

益母草，購(gòu)于市場(chǎng)。

鹽酸水蘇堿對(duì)照品（批號(hào)：110712-201916），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純），CNW；冰醋酸（AR）、乙醇（AR），天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)；水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀（配備Corona Veo RS CAD 檢測(cè)器），Chromeleon 7.0 色譜工作站，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；水浴鍋，常州國(guó)宇。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Welch Ultimate XB-Diol（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶0.2%冰醋酸=80 ∶20；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。CAD 檢測(cè)器條件：霧化溫度為40 ℃，數(shù)據(jù)采集頻率為20 Hz，過(guò)濾常數(shù)為1.0 s。

1.3.2 對(duì)照溶液的制備

取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，在精密稱(chēng)定后加入70%乙醇溶液配制成濃度為0.5 mg·mL-1的溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備

將益母草磨成粉過(guò)三號(hào)篩，稱(chēng)取粉末約1.0 g，在精密稱(chēng)定后置于具塞錐形瓶中，在精密加入25 mL 的70%乙醇溶液后，稱(chēng)定重量，水浴加熱回流2 h，放冷后再稱(chēng)定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻后過(guò)濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。

1.3.4 樣品的測(cè)定

取不同產(chǎn)地批次的益母草，按1.3.3 項(xiàng)下方法操作，按1.3.1色譜條件測(cè)定，同時(shí)也按照2020年版《中國(guó)藥典》一部中益母草項(xiàng)下的鹽酸水蘇堿測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算鹽酸水蘇堿的含量，將兩者結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 檢測(cè)器的選擇

在《中國(guó)藥典》及多個(gè)地方標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)中，益母草中鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法多選擇高效液相色譜儀搭配蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。由于蒸發(fā)光散射檢測(cè)器本身的特殊性，往往在實(shí)際操作當(dāng)中需要提前開(kāi)啟蒸發(fā)光穩(wěn)定較長(zhǎng)的時(shí)間，而且基線(xiàn)噪音的影響比較明顯。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇同為通用檢測(cè)器的電霧式檢測(cè)器代替蒸發(fā)光散射檢測(cè)器對(duì)鹽酸水蘇堿進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)定結(jié)果與HPLC-ELSD 法基本一致。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

在《中國(guó)藥典》中，益母草中鹽酸水蘇堿的測(cè)定方法為HPLC-ELSD，流動(dòng)相為乙腈-0.2%冰醋酸；當(dāng)把相同的流動(dòng)相用于HPLC-CAD 時(shí)發(fā)現(xiàn)，能把供試品中的干擾峰分離，但分離度只能達(dá)到1.04 左右。本實(shí)驗(yàn)將流動(dòng)相改為甲醇-0.2%冰醋酸，供試品中的干擾峰會(huì)被提前洗脫，鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰前后均沒(méi)有影響結(jié)果的干擾峰，并且檢測(cè)結(jié)果與HPLC-ELSD 基本一致[9-10]。這說(shuō)明，以甲醇-0.2%冰醋酸為流動(dòng)相，利用電霧式檢測(cè)器檢測(cè)鹽酸水蘇堿效果較好。

2.2 色譜圖

按優(yōu)化后的1.3.1 色譜條件測(cè)定對(duì)照品溶液和供試品溶液，可看出供試品中其他成分對(duì)鹽酸水蘇堿目標(biāo)峰無(wú)干擾。鹽酸水蘇堿對(duì)照品溶液、益母草供試品溶液色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 益母草HPLC-CAD 色譜圖

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 線(xiàn)性和范圍

將1.3.2 對(duì)照溶液（實(shí)際濃度為0.501 mg·mL-1）依次進(jìn)樣1 μL、2 μL、3 μL、6 μL、8 μL 和10 μL 測(cè)定各成分的峰面積，以進(jìn)樣量（μg）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（x），以峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（y），進(jìn)行線(xiàn)性回歸。結(jié)果表明，鹽酸水蘇堿在0.50～5.01 μg 線(xiàn)性良好，回歸方程為y=5.631 2x-0.276 2，r=0.999 5。

2.3.2 精密度

精密吸取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣6 μL，按1.3.1 色譜條件測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果見(jiàn)表1。鹽酸水蘇堿峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為0.33%，表明儀器精密度滿(mǎn)足要求。

表1 鹽酸水蘇堿精密度測(cè)定結(jié)果表

2.3.3 重復(fù)性

精密稱(chēng)取同一批益母草粉末（過(guò)三號(hào)篩）6 份（每份約1 g），按1.3.3 項(xiàng)下方法操作，制成供試品溶液，按1.3.1 色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。樣品鹽酸水蘇堿含量的RSD 是0.69%，表明本法重復(fù)性良好。

表2 鹽酸水蘇堿重復(fù)性測(cè)定結(jié)果表

2.3.4 準(zhǔn)確性

精密稱(chēng)取已知含量的同一批益母草粉末（過(guò)三號(hào)篩）6 份（每份約1 g），每份加入鹽酸水蘇堿4.008 mg，按1.3.3 項(xiàng)下方法操作，按1.3.1 色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。鹽酸水蘇堿的平均回收率是100.28%，RSD 為1.43%，表明本法準(zhǔn)確性良好。

表3 鹽酸水蘇堿準(zhǔn)確性測(cè)定結(jié)果表

2.3.5 穩(wěn)定性

對(duì)同一供試品溶液，分別于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h 和24 h 的6 個(gè)時(shí)間點(diǎn)，按1.3.1 色譜條件測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。鹽酸水蘇堿峰面積的RSD 為0.58%，可表明益母草供試品溶液中鹽酸水蘇堿成分能在24 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表

2.4 樣品的測(cè)定

對(duì)6 批次益母草樣品中鹽酸水蘇堿含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，各批益母草的CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果的相對(duì)平均偏差為0%～1.08%，表明采用CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果基本一致。另對(duì)6 批次的CAD 法與ELSD 法2 組結(jié)果使用SPSS 22 進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果顯示Levene 統(tǒng)計(jì)量為1.509，顯著性P值為0.247 ＞0.05，故方差齊性；兩組間獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量t=-0.276，P值為0.065 ＞0.01，表明CAD 法結(jié)果與ESLD 法結(jié)果不存在差異。

表5 含量測(cè)定結(jié)果表

3 結(jié)論

近年來(lái)，電霧式檢測(cè)器作為一種新型通用型檢測(cè)器在中藥分析領(lǐng)域表現(xiàn)出了廣泛的適用性，尤其適用于皂苷、糖類(lèi)和生物堿類(lèi)等無(wú)紫外吸收或弱紫外吸收成分的分析與檢測(cè)[11]。雖然電霧式檢測(cè)器與紫外檢測(cè)器、蒸發(fā)光檢測(cè)器等檢測(cè)器相比具有較大的優(yōu)勢(shì)，但其缺點(diǎn)也同樣明顯，如待測(cè)物需先經(jīng)干燥，故難以檢測(cè)揮發(fā)性物質(zhì)；該監(jiān)測(cè)器基于氣溶膠方法獲得的濃度和峰面積均為非線(xiàn)性關(guān)系，在實(shí)際計(jì)算中不如紫外檢測(cè)器簡(jiǎn)單方便，在識(shí)別某個(gè)峰或進(jìn)行峰純度分析時(shí)也不能像質(zhì)譜探測(cè)器能深度探索[12]。但在實(shí)際使用當(dāng)中可以看出，電霧式檢測(cè)器已逐漸成為目前檢測(cè)器分析中的重要補(bǔ)充，對(duì)提高準(zhǔn)確度、擴(kuò)大檢測(cè)范圍起到重要的作用。本文采用高效液相色譜儀搭配電霧式檢測(cè)器法檢測(cè)益母草中鹽酸水蘇堿含量，具有方法重復(fù)性良好、準(zhǔn)確度較高、靈敏度較高、操作簡(jiǎn)單便捷等優(yōu)點(diǎn)，可用于對(duì)益母草的質(zhì)量控制。接下來(lái)，可繼續(xù)探究本方法對(duì)于其他物質(zhì)的適用性，并因?yàn)橥ㄓ眯詸z測(cè)器的特性，可以將其延伸至對(duì)多種類(lèi)型的化合物進(jìn)行同時(shí)檢測(cè)。