火炭母通過調控TLR4-TBK1信號通路改善鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸的炎癥反應

張易安 , 郭琰娜 , 劉 妍 , 劉涵笑 , 沈幸玲 , 劉逸雷 , 唐陸平 , 何永明

(佛山科學技術學院動物醫學系 , 廣東 佛山 528000)

沙門菌是重要的人獸共患病原體之一。沙門菌病不僅能降低成年動物的繁殖力,還會對幼齡動物的健康產生嚴重危害,影響人類健康和畜牧業的發展[1,2]。鼠傷寒沙門菌(Salmonellatyphimurium,S.typhimurium)是沙門菌屬目前分離率最高的菌型之一,其感染機體時,能逃避免疫系統并在體內進行定殖,最終可引起動物的傷寒、腸炎和敗血癥狀。一直以來,藥物在防治鼠傷寒沙門菌病中存有局限性,但中草藥在抑菌方面有著安全性好、有效成分多和靶點多等特點,而且中草藥不僅能提高機體整體免疫力達到抗菌抗炎的效果,還能降低細菌耐藥性和節約治療成本[3],應用安全有效的中草藥防治鼠傷寒沙門菌病一直以來受到廣泛關注。

火炭母(PolygonumchinenseL.,PCL)為常用中草藥之一,常用于治療腸炎、痢疾和肝炎等疾病[4,5]。關于火炭母對沙門菌感染機體腸道的保護作用和作用機制,目前鮮見報道。本試驗旨在通過對鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型進行預防性給藥,結合組織病理學檢查和Western blot,檢測與調控機體免疫功能相關的TLR4-TBK1 信號通路的相關蛋白,最終探討火炭母對小鼠空腸免疫的影響及其可能的作用機制。本試驗結果可為臨床開發防治畜禽沙門菌病藥物,提高畜禽生產效益提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株 鼠傷寒沙門菌(S.typhimurium,ATCC 14028),廣東省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 主要藥品和試劑 火炭母(PCL,批號:190501),購自北京同仁堂中藥有限公司佛山分公司;慶大霉素(Gentamicin,GM,批號:102328948),購自 Sigma 公司;Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)、β干擾素 TIR 結構域銜接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)、TANK結合激酶1(TANK binds kinase 1,TBK1)、磷酸化TANK結合激酶1(Phosphonylated TANK binds kinase 1,p-TBK1)、β干擾素(Interferon-β,IFN-β)、干擾素調節因子3(Interferon regulatory factor 3,IRF3)、磷酸化干擾素調節因子3(Phosphorylated interferon regulatory factor 3,p-IRF3)、白介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1 β)、核因子κB p65(Nuclear factor kappa-B p65,NF-κB p65)和β肌動蛋白(β-actin)抗體,(批號分別為:14358、4596、38066、5483、97450、4302、29047、12912、12242、8242和4970),均購自美國 Cell Signaling Technology 公司;γ干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)抗體(批號:ab9657),購自美國 Abcam公司;增強型化學發光試劑(Enhanced chemiluminescence,ECL)顯色液(批號:102031748),購自 Bio-Rad公司。

1.3 主要儀器 航方分體式煎藥壺,潮州市一壺百飲電氣實業有限公司產品;Supper 10 FV 超純水儀,Thelab 公司產品;SW-CJ-1 FD 超凈臺,蘇凈安泰公司產品;Tanon-5200 SF,廣州譽維生物科技儀器有限公司產品;EPS 200 電泳儀和DK-80 電熱恒溫水浴鍋,上海天能科技有限公司產品;DW-86 L 626 超低溫冰箱,Haier 公司產品;SIM-F 140 AY 65-PC 自動制冰機,PHcbi 公司產品。

1.4 火炭母口服液的制備及其質量控制 將火炭母以藥液比 1∶30 加入超純水,浸泡 0.5 h,煎煮 30 h,收集藥液;重復煎煮 3 次,合并藥液;紗布過濾,濃縮至 1 g/mL 濃度,置于 4 ℃ 冰箱密封保存。高效液相色譜法(High performance liquid chromatography,HPLC)檢測火炭母主要化學成分,以建立其質量評價標準。試驗所用火炭母口服液的 3 種指示成分質量控制:沒食子酸≥0.9 mg/g,綠原酸≥2.5 mg/g,金絲桃苷≥4.7 mg/g。

1.5 試驗動物飼養和給藥 雌性 BALB/c 小鼠,體重 14～16 g,由廣東省醫學實驗動物中心(合格證號:202106942,廣州)提供,生產許可證號:SCXK(粵)2020—0054。小鼠購回后適應性飼養 1 周,環境溫度(23±2) ℃,12 h 光/暗循環,自由飲食和飲水。所有動物工作均按照中華人民共和國科技部制定的《實驗動物護理使用指南》(批準文號:2006-398)進行,并經佛山科學技術學院實驗動物倫理委員會批準。選擇臨床健康、體重均一的 48 只雌性 BALB/c小鼠,隨機分為6個組:空白對照組(Blank-control,滅菌生理鹽水)、模型組(Model,鼠傷寒沙門菌+滅菌生理鹽水)、陽性藥物組[Positive drug,鼠傷寒沙門菌+20 mg/(kg·bw)慶大霉素]、火炭母高劑量組[簡稱 PCL-H,鼠傷寒沙門菌+16 g/(kg·bw) 火炭母]、火炭母中劑量組[簡稱 PCL-M,鼠傷寒沙門菌+8 g/(kg·bw)火炭母]和火炭母低劑量組[簡稱 PCL-L 組,鼠傷寒沙門菌+4 g/(kg·bw)火炭母],每組8只小鼠。試驗動物灌胃給藥,給藥體積為 0.2 mL/(10 g·bw),連續給藥 8 d。經過 2 d 預防性給藥后,灌胃 0.2 mL 半數致死量(Lethal dose 50%,LD50) 鼠傷寒沙門菌(5×104CFU/mL)致病(空白對照組除外)。染毒后第 6 天,處死小鼠,取空腸用于組織病理學檢查和 Western blot。

1.6 空腸組織病理學檢查 將空腸固定于4%多聚甲醛溶液中,石蠟包埋后切片,進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,于光學顯微鏡下觀察其組織病理學變化情況。

1.7 Western blot 取空腸用 RIPA 裂解液勻漿,經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)將蛋白分離,隨后電轉印跡到 PVDF膜。將目的膜條帶放于 5% 脫脂奶粉中封閉 1 h;然后于 4 ℃下過夜孵育一抗(TLR4、TRIF、TBK1、p-TBK1、IFN-β、IFN-γ、IRF3、p-IRF3、IL-6、IL-1β、NF-κB p65和β-actin);用 TBST 緩沖液洗滌 3 次,每次 15 min;隨后使用二抗孵育 1 h;TBST 緩沖液洗滌 3 次后,用 ECL顯色液處理,采集圖像,進行灰度分析。

1.8 統計分析 使用 SPSS 20.0 軟件進行數據分析,定量資料采用“平均數±標準差(Mean±SD)”表示。組間比較采用單因素方差分析,P< 0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸形態變化的影響 小鼠空腸組織病理學變化如圖1 所示,空白對照組小鼠空腸結構完整、清晰;模型組小鼠空腸組織結構之間不緊密,杯狀細胞增多,腸腺紅細胞增多。與模型組相比,陽性藥物組小鼠空腸出現少量固有層炎性細胞浸潤;火炭母各組小鼠空腸杯狀細胞和腸腺紅細胞明顯減少。

圖1 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸形態變化的影響(H.E.染色,400×)Fig.1 Effects of Polygonum chinense L. on jejunum morphology in mice infected with S.typhimurium (H.E.staining,400×)A:空白對照組; B:模型組; C:陽性藥物組; D:火炭母高劑量組; E:火炭母中劑量組; F:火炭母低劑量組藍色箭頭:杯狀細胞; 紅色箭頭:腸腺紅細胞; 黃色箭頭:固有層炎性細胞浸潤; 綠色箭頭:細胞變性,呈網孔狀A:Blank control group; B:Model group; C:Positive drug group; D:PCL-H group; E:PCL-M group; F:PCL-L groupBlue arrow:Goblet cells; Red arrow:Intestinal glandular erythrocytes; Yellow arrow:Lamina propria inflammatory cell infiltration;Green arrow:Cell degeneration,mesh shape

2.2 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸IFN-β和IFN-γ蛋白表達的影響 結果如圖2所示,與空白對照組相比,模型組小鼠空腸中 IFN-β蛋白表達顯著上升(P<0.05),IFN-γ 蛋白表達顯著下降(P<0.05);與模型組相比,陽性藥物組小鼠空腸中 IFN-β 和 IFN-γ 蛋白表達顯著上升(P<0.05),PCL-H 組小鼠空腸中 IFN-β 蛋白表達顯著上升(P<0.05),PCL-M 組 IFN-β蛋白表達顯著下降(P<0.05),且火炭母各劑量組小鼠空腸中 IFN-γ 蛋白表達均顯著上升(P<0.05)。

2.3 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TBK1和IRF3蛋白表達的影響 結果如圖3所示,與空白對照組相比,模型組小鼠空腸中IRF3和p-TBK1蛋白表達均顯著上升(P<0.05),p-IRF3和TBK1表達無明顯變化(P>0.05);與模型組相比,陽性藥物組和火炭母各劑量組小鼠空腸中TBK1、p-TBK1和IRF3蛋白表達均顯著上升(P<0.05),陽性藥物組和PCL-H組p-IRF3蛋白表達顯著上升(P<0.05)。

圖3 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TBK1和IRF3蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Polygonum chinense L. on TBK1 and IRF3 protein expression in jejunum of mice infected with S.typhimuriumA:Western blot檢測TBK1和IRF3蛋白表達; B～E:分別為IRF3、p-IRF3、TBK1和p-TBK1蛋白相對表達A:Western blot analysis of TBK1 and IRF3 protein expression; B-E:Relative protein expression of IRF3,p-IRF3,TBK1 and p-TBK1,respectively

2.4 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TLR4-TRIF通路蛋白表達的影響 結果如圖4所示,與空白對照組相比,模型組小鼠空腸中TLR4蛋白表達顯著上升(P<0.05),而TRIF蛋白表達無顯著變化(P>0.05);與模型組相比,陽性藥物組和不同劑量火炭母處理組小鼠空腸中TLR4和TRIF蛋白表達均顯著上升(P<0.05)。

圖4 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸TLR4-TRIF通路蛋白表達的影響Fig.4 Effect of Polygonum chinense L. on TLR4-TRIF pathway protein expression in jejunum of mice infected with S.typhimuriumA:Western blot 檢測TLR4-TRIF通路蛋白表達; B、C:分別為TLR4和TRIF蛋白相對表達A:Western blot analysis of TLR4-TRIF pathway protein expression; B,C:Relative protein expression of TLR4 and TRIF,respectively

2.5 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸促炎因子表達的影響 結果如圖5所示,與空白對照組相比,模型組小鼠空腸中IL-6、IL-1β和NF-κB p65蛋白表達均顯著上升(P<0.05);與模型組相比,陽性藥物組和火炭母不同劑量組IL-1β和NF-κB p65蛋白表達均顯著下降(P<0.05),陽性藥物組IL-6蛋白表達顯著上升(P<0.05),PCL-L組IL-6蛋白表達顯著下降(P<0.05)。

圖5 火炭母對鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸促炎因子表達的影響Fig.5 Effect of Polygonum chinense L. on jejunal proinflammatory factor in mice infected with S.typhimuriumA:Western blot 檢測IL-6、IL-1β和NF-κB p65通路蛋白表達; B～D:分別為IL-6、IL-1β和NF-κB p65蛋白相對表達A:Western blot analysis of IL-6,IL-1β and NF-κB p65 pathway protein expression; B-D:Relative-protein expression of IL-6,IL-1β and NF-κB p65,respectively

3 討論

中草藥對機體免疫系統有良好的保護作用,并由此減少細菌和病毒等生物因子引起的炎癥反應?；鹛磕钢饕铀岷忘S酮類成分[6];本實驗室首次對廣東產火炭母所含的酚酸類(沒食子酸、綠原酸)和黃酮醇苷類(金絲桃苷)兩類化學成分的含量同時進行測定,以保證藥材的品質。據報道,沒食子酸具有抑菌和抗炎等生物活性,其對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和鼠傷寒沙門菌等均有較好的抑制作用[7];綠原酸具有抗炎、抗菌和改善免疫調節等作用[8],重要的是,綠原酸對腸炎沙門菌具有抗菌活性[9];金絲桃苷具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用[10]。這些成分可能是火炭母防治腸炎的物質基礎,故本試驗建立了鼠傷寒沙門菌感染小鼠模型,探討火炭母對其空腸的保護作用及其潛在機制。

沙門菌感染機體后在腸道內大量繁殖,并在此過程中持續產生毒素,當毒素超過腸道自身免疫調節閾值時會導致腹瀉,還會導致細胞釋放TNF-α和IL-1β等多種促炎細胞因子[11]。本試驗結果顯示,鼠傷寒沙門菌感染后小鼠空腸組織杯狀細胞增多、腸腺紅細胞增多、結構松散,腸道中炎性因子IL-6和IL-1β水平上升,而火炭母能顯著減少小鼠空腸組織中的杯狀細胞和腸腺紅細胞,改善腸道損傷,同時能顯著抑制IL-6和IL-1β蛋白的表達,減輕空腸炎癥。

研究發現,沙門菌感染機體過程中,能誘導I型IFN的產生,特別是IFN-β的產生,以抑制先天性炎癥反應[12]。另有研究發現,大腸桿菌感染機體時能通過誘導Ⅰ型IFN的表達維持腸道屏障功能,保護腸道屏障不被破壞[13]。在哺乳動物中,Ⅰ型IFN通過誘導干擾素刺激基因(Interferon-stimulated gene,ISG)的產生,抑制過度的炎癥反應來抑制細菌感染,增加干擾素水平,從而改善沙門菌感染引起的疾病[14]。研究表明,Ⅱ型IFN可控制腸道組織中的病原體負荷,調節杯狀細胞黏蛋白的釋放,提高Ⅱ型IFN的產生可改善鼠傷寒沙門菌引起的疾病[15]。有研究發現,肉雞感染鼠傷寒沙門菌后,空腸中的 IFN-γ 含量降低,TNF-α 和 IL-1β 蛋白表達增高[16]。綠原酸是本試驗中火炭母口服液所含的主要化學成分之一,該化合物可通過抑制 NF-κB進而抑制脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導的IL-1β、IL-6、IFN-γ 和 TNF-α 等炎癥因子的基因表達,通過抑制活性蛋白質來緩解炎癥[17,18]。本試驗結果顯示,沙門菌感染小鼠的空腸中 IFN-β 蛋白表達上升,IFN-γ 表達下降,而火炭母各劑量組小鼠空腸中IFN-γ蛋白表達均上升,火炭母高劑量組小鼠空腸中IFN-β蛋白表達上升,提示火炭母可能通過增強腸道免疫提高腸道屏障功能。當病原體侵襲機體后,TBK1蛋白會發出信號,引發抑制病原體復制的程序[13]。在TBK1缺乏的細胞中,病原體能夠大量繁殖[19],提示沙門菌感染小鼠空腸的免疫功能變化可能與TBK1有關。TBK1的典型抗病毒活性依賴于轉錄因子IRF3的磷酸化。磷酸化是IRF3的活化形式,其活化形式移至細胞核可誘導IFN-α和IFN-β的生成[20]。本試驗結果顯示,沙門菌感染小鼠的空腸中IRF3和p-TBK1蛋白表達明顯增強,火炭母能提高沙門菌感染小鼠空腸中IRF3、TBK1、p-IRF3和p-TBK1的蛋白表達,提示火炭母提高沙門菌小鼠空腸免疫功能可能與TBK1上調有關。

當細菌感染機體時,腸道細胞表面的Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)和細胞內的 Nod 樣受體(NOD-like receptors,NLRs)對細菌的識別起關鍵作用。沙門菌作用機體能上調TLR4的表達,誘導細胞因子和趨化因子進行免疫調節[21]。TLR4誘導TBK1激活進一步介導IRF3的磷酸化,并誘導IFN-β表達[22]。本試驗結果顯示,鼠傷寒沙門菌感染小鼠的空腸中TLR4蛋白表達增強,火炭母能提高鼠傷寒沙門菌小鼠空腸中TLR4和TRIF蛋白表達水平,且與p-TBK1、p-IRF3和IFN的變化趨勢一致,提示火炭母可能通過上調TLR4-TBK1信號通路增強鼠傷寒沙門菌感染小鼠空腸中IFN-β和IFN-γ蛋白表達,使其免疫功能上調。

綜上所述,本試驗采用鼠傷寒沙門菌感染BALB/c小鼠建立小鼠腸炎模型,探索火炭母對空腸免疫的影響,結果表明,火炭母可能通過上調 TLR4-TBK1信號通路誘導干擾素的產生,從而改善鼠傷寒沙門菌誘導的腸炎。