豬傳染性胸膜肺炎病例報告

李瑜祥 , 魏唐婷 , 胡秀花 , 蘇瑞景 , 王少林 , 許建海 , 孟 迪 , 胡艷欣

(1.中國農業大學動物醫學院 , 北京 海淀 100193 ; 2.福清市畜牧獸醫中心 , 福建 福清 350300)

2020年12月,某豬場個別育肥豬突然出現了體溫升高、呼吸窘迫等癥狀,用抗生素鹽酸林可霉素、復方新諾明和鏈霉素等治療后沒有好轉并且癥狀持續惡化,幾天后病豬死亡,對其進行了大體剖檢和病料采集。根據流行病學、臨床癥狀和大體病變,疑似該豬患有豬傳染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumoniae,PCP)。為了進一步確診是否為PCP,并深入探討該病的病理變化特點,進行了后續的實驗室檢測和組織病理學分析。

1 材料與方法

1.1 病料來源 病豬死亡后立即進行大體剖檢和取材。無菌采集病死豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結、血液和胸腔積液。將收集的病料分為兩部分,一部分先用液氮保存,后移至實驗室-80 ℃冰箱中冷凍保存,待進行細菌分離和鑒定,另一部分固定在4%甲醛溶液中待制作石蠟切片。

1.2 主要試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂(Tryptone soybean agar,TSA)培養基和胰蛋白胨大豆肉湯(Tryptone soybean broth,TSB)培養基,均購自紹興天恒生物科技有限公司;輔酶Ⅰ(Nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),購自生工生物工程(上海)股份有限公司;胎牛血清和PCR試劑盒,均購自北京索萊寶科技有限公司;革蘭染色試劑盒,購自北京中杉金橋生物公司;4%甲醛固定液,由實驗室自行配置。

1.3 主要儀器 基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀,賽默飛世爾科技公司產品;PCR儀,Applied Biosystems產品;光學顯微鏡,Olympus corporation產品。

1.4 試驗方法

1.4.1 細菌分離培養 利用消毒后的接種環無菌采集病料,將每份病料分別劃線接種于TSA培養基(含5%胎牛血清和0.01% NAD),在37 ℃條件下培養24 h,之后挑取TSA培養基上的單個菌落進行劃線培養,純化2次后觀察平皿上的菌落形態,根據說明書操作對純化后的菌株進行革蘭染色鏡檢。將劃線培養的單菌落接種于TSB培養基(含5%胎中血清和0.01%NAD),振蕩培養12 h,留樣備用。

1.4.2 細菌分子生物學和血清型鑒定 利用質譜分析和PCR進行細菌鑒定。按照基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀手冊說明進行操作,將每份病料純化后的單個菌落加入樣品孔中進行檢測。該系統首先識別分子量為2～20 kDa的圖譜,之后采集圖譜進行分析。根據結果與儀器數據庫內的參考圖譜進行比對,依據匹配程度來判斷菌株種類。

利用水煮模板法提取細菌DNA,設計并合成用于鑒定胸膜肺炎放線桿菌(Actinobczcilluspleuropeu-monicze,APP)16S rDNA的引物,上游引物:5′-GTG-GCACTGACGGTGATGAT-3′,下游引物:5′-GGCCA-TCGACTCAACCAT-3′,目標片段大小377 bp。鑒定APP血清型分型所要使用的引物序列見表1,引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系(25 μL):2×TaqMaster Mix 12.5 μL,ddH2O 9.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL。16S rDNA PCR反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 30 s,56 ℃ 退火30 s,72 ℃延伸 30 s,進行35個循環;72 ℃延伸10 min。1、2、3、5和7型APP反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 50 s,62 ℃ 退火50 s,72 ℃延伸1 min 30 s,進行35個循環;72 ℃延伸10 min。8型APP反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 50 s,60 ℃ 退火50 s,72 ℃延伸1 min 30 s,進行35個循環;72 ℃延伸10 min。15型APP反應程序:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性 30 s,61 ℃ 退火1 min 30 s,72 ℃延伸2 min,進行25個循環;68 ℃延伸15 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,將擴增出陽性條帶的PCR產物送北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序并比對。

表1 豬胸膜肺炎放線桿菌血清型鑒定引物Table 1 Primer of serotype identification of Actinobacillus pleuropneumoniae

1.4.3 組織病理學分析 將所采集的組織樣品在4%甲醛溶液中固定48 h,對樣品進行修塊、脫水,常規石蠟包埋,制備的石蠟切片厚度為3～4 μm,利用自動染色機完成蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,H.E.)染色,在光學顯微鏡下進行觀察并采集病變典型的圖片。

2 結果

2.1 臨床癥狀和剖檢病理變化 病豬表現精神沉郁、體溫升高(41～42 ℃)、咳嗽和呼吸困難,鼻內流出血色樣泡沫分泌物等癥狀。剖檢發現胸腔有大量積液(圖1A),肺臟腫大并可見彌散性大面積的出血灶(圖1B)。

圖1 大體剖檢觀察Fig.1 Gross necropsy observationA:胸腔; B:肺臟A:Pleural cavity; B:Lung

2.2 細菌分離培養 從病豬的胸腔積液、肺臟和心臟中都分離出了菌株,純化2次后在TSA培養基上主要可見數個針尖大小、隆起、表面光滑、邊緣整齊的半透明呈露珠狀的白色菌落(圖2A),革蘭染色后,單個、成雙或鏈狀的革蘭陰性球桿菌在光鏡視野下清晰可見,符合APP的形態特征(圖2B)。

圖2 細菌分離培養Fig.2 Bacteria isolation and cultureA:菌落形態; B:革蘭染色(100×)A:Colony morphology; B:Gram staining(100×)

2.3 細菌分子生物學鑒定 質譜檢測結果顯示,病死豬胸腔積液、血液、心臟、肺臟和腎臟中均含有APP(表2)。16S rDNA PCR鑒定結果顯示,上述病料均可擴增出APP陽性條帶(圖3),初步判定病豬體內的主要菌株為APP。

圖3 不同病料分離菌株16S rDNA的PCR鑒定Fig.3 16S rDNA PCR identification of isolates from different specimensM:DL2 000 DNA相對分子質量標準; 1:血液1; 2:血液2; 3:血液3; 4:淋巴結; 5:脾臟; 6:心臟; 7:肝臟; 8:肺臟; 9:胸腔積液1; 10:胸腔積液2; 11:胸腔積液3; 12:腎臟; 13:陽性對照; 14:陰性對照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Blood 1; 2:Blood 2; 3:Blood 3; 4:Lymph node; 5:Spleen; 6:Heart; 7:Liver; 8:Lung; 9:Pleural effusion 1; 10:Pleural effusion 2; 11:Pleural effusion 3; 12:Kidney; 13:Positive control; 14:Negative control

表2 不同病料分離菌株的質譜鑒定Table 2 Mass spectrometry identification of isolates from different specimens

2.4 細菌血清型鑒定 細菌血清型PCR鑒定結果顯示,各樣本中含有符合血清型7型條帶的目標片段,大小為396 bp(圖4)。其測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對為APP血清型7型,表明該豬所感染的APP為血清型7型。

圖4 胸膜肺炎放線桿菌血清型的PCR鑒定Fig.4 PCR identification of Actinobacillus pleuropneumoniae serotypeM:DL2 000 DNA相對分子質量標準; 1:胸腔積液1; 2:胸腔積液2; 3:心臟; 4:血液1;5:陽性對照a; 6:陽性對照b; 7:胸腔積液3; 8:血液2; 9:血液3; 10:肺臟; 11:腎臟;12:陰性對照M:DL2 000 DNA Marker; 1:Pleural effusion 1; 2:Pleural effusion 2; 3:Heart; 4:Blood 1; 5:Positive control a; 6:Positive control b; 7:Pleural effusion 3; 8:Blood 2; 9:Blood 3; 10:Lung; 11:Kidney; 12:Negative control

2.5 組織病理學分析

2.5.1 肺臟 顯微鏡下可見,肺小葉間質疏松水腫,淋巴管擴張形成淋巴栓(圖5A),有大量炎性細胞浸潤,主要為中性粒細胞和淋巴細胞(圖5B);有的肺小葉局部呈現嚴重出血性肺炎(圖5C),肺臟正常組織結構消失,肺泡和支氣管管腔中可見大量的炎性滲出液和紅細胞聚集,殘存的肺泡代償性擴張(圖5D);有的肺小葉呈現纖維素性肺炎,肺泡上皮細胞大量增生,呈島嶼狀排列(圖5E);肺泡和肺間質內可見藍染的菌團(圖5F)。

圖5 肺臟組織病理學檢測(H.E.染色)Fig.5 Histopathological examination of the lung(H.E. staining)A、C、E:20×; B、D、F:40×黑色箭頭:肺小葉間質疏松水腫、淋巴管擴張形成淋巴栓; 藍色箭頭:炎性細胞浸潤; 綠色箭頭:殘存的肺泡代償性擴張; 黃色箭頭:肺泡上皮細胞大量增生; 白色箭頭:藍染菌團Black arrow:Pulmonary lobular interstitial looseness and edema,lymphatic vessel dilatation forming lymphatic embolus; Blue arrow:Inflammatory cell infiltration; Green arrow:Compensatory expansion of the remaining alveoli; Yellow arrow:Abundant proliferation of alveolar epithelial cells; White arrow:Blue-stained clumps

2.5.2 其他臟器 肝臟、淋巴結、腎臟和心肌組織均可見明顯的組織病理學變化。肝小葉中央靜脈和肝竇淤血、有散在壞死灶,中央靜脈管壁下組織疏松水腫(圖6A);淋巴結可見淋巴濾泡中淋巴細胞壞死排空,毛細血管擴張充血(圖6B);脾臟表現出急性脾炎的病理學變化,大面積出血,白髓與紅髓之間的界限不清晰,白髓面積縮小,動脈周圍淋巴鞘萎縮,大量淋巴細胞壞死排空(圖6C);腎臟可見嚴重水腫、腎小管脫離基底膜,腎小管上皮細胞廣泛變性壞死,腎間質有明顯的結締組織增生(圖6D)和炎性細胞浸潤(圖6E);心臟的心肌纖維間大量紅細胞聚集,呈現局灶性出血灶(圖6F)。

圖6 其他臟器組織病理學檢測(H.E.染色,40×)Fig.6 Histopathological examination of other organs tissues (H.E. staining,40×)A:肝臟; B:淋巴結; C:脾臟; D:腎臟; E:腎臟; F:心臟黑色箭頭:中央靜脈管壁下組織疏松水腫; 藍色箭頭:淋巴濾泡中淋巴細胞壞死排空; 綠色箭頭:腎小管脫離基底膜; 黃色箭頭:炎性細胞浸潤; 白色箭頭:心肌纖維間大量紅細胞聚集A:Liver; B:Lymph node; C:Spleen; D:Kidney; E:Kidney; F:HeartBlack arrow:The tissue under the central vein wall was loose and edema; Blue arrow:Necrotic emptying of lymphocytes in lymphoid follicles; Green arrow:Renal tubules detached from the basement membrane; Yellow arrow:Inflammatory cell infiltration; White arrow:Massive aggregation of red blood cells between myocardial fibers

3 討論

PCP是由APP感染導致的一種高傳染性、致死性的豬呼吸道傳染病,由于環境、品系、機體免疫狀態和APP血清型等因素不同而對豬的致病性有所差異。該病原自1957年在英國被首次分離以來,已分離鑒定出18個血清型(1～18型)[1]。有研究表明,胸腔和肺臟是該病的主要病理損傷部位[2],臨床表現為急性或慢性纖維素性胸膜肺炎[3]。

本試驗在剖檢病死豬時發現胸腔積液和肺臟腫大出血等癥狀。組織病理學觀察結果亦顯示病死豬多臟器發生病變,尤其以肺臟病變最為明顯,呈現出血性肺炎和纖維性肺炎的病理學變化,同時可觀察到藍染菌團。結合細菌學檢查結果,推測該病豬可能感染了血清型7型APP菌,細菌在肺內繁殖,引發嚴重的肺炎,最終導致呼吸困難等急性豬胸膜肺炎的癥狀。在急性感染期間,該菌主要通過淋巴管和血管在病豬體內傳播和釋放毒素,引起感染豬發生菌血癥和毒血癥[4],最終導致感染豬的死亡。

研究表明,肺臟呈現纖維素性肺炎的病理損傷是急性豬傳染性胸膜肺炎的特征表現[5,6]。在本試驗中,病死豬的肺臟組織也有明顯的出血性纖維素性滲出,同時可見大量肺泡上皮細胞呈島嶼狀聚集,可能是疾病正在由急性向亞急性轉變,繼續發展有可能成為亞急性型特征性病變“肉芽腫”。病死豬的心臟、肝臟、腎臟、淋巴結和脾臟等也表現出不同程度的病理損傷。質譜檢測結果顯示,大部分病變組織中都有APP存在,提示這些部位的病理組織學變化與APP感染有關。因此,心肌纖維間的散在出血灶,腎小管上皮細胞的變性壞死可能是APP感染引起的病理學變化。

PCP作為一種細菌感染性疾病,感染初期出現的急性肺損傷的程度決定了病情是否進一步惡化,所以盡早確診才能快速防控[7]。因此,在面對豬場豬群突發PCP時,靈敏高效的檢測方法是極其重要的。目前,酶聯免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbnent Assay,ELISA)是在豬群中監測豬APP最為常用的方法,該方法經濟且方便。但在某些亞臨床感染中,感染豬的血清學檢查結果可能為陰性,僅靠ELISA方法檢測將會影響后續的診斷和治療[8]。本試驗利用PCR和質譜分析結合來鑒定APP,檢測結果準確,但在實際操作中存在難度大、耗時長等問題,無法應對豬場的需求。因此,研發針對PCP的成本低、準確性高、操作簡單的診斷方法依舊是熱點問題。

對于PCP的防控,首先需要加強豬場的飼養管理,其次應采取相關措施保障生物安全,定期進行血清學檢查,并根據血清學檢查結果制定相應的免疫程序進行免疫接種。近年來,我國不同地區的規?；i場常有APP感染的報道出現,目前 APP 血清型 1～5、7～10 和 15 型的相關抗體已經在我國許多豬場成功分離或者檢測得到,且不同地域的優勢血清型存在差異[9],例如:APP血清型1型主要在福建和海南存在,血清型2、3和7型主要分布于甘肅、青海和寧夏等,血清型3、7和9型是湖南和湖北的優勢血清型[10]。本試驗中所測得的血清型7型APP在我國最為普遍[11]。宋志強等統計2017—2019年關于PCP的屠宰檢查結果發現,3年來我國豬群感染PCP的平均概率為12%[12],相較于以前感染率有所升高。因此,建立PCP分離菌株血清型分布的流行病學數據庫,依據大數據來篩選預測優勢血清型,對于APP疫苗的研發和PCP的防治具有重要意義[13]。當養殖場中發現有豬群疑似感染PCP時,應及時隔離患病豬,由于不同區域豬場長期使用的抗生素不同,治療時需要有針對地篩選出敏感藥物并及時進行治療,才能有效阻止APP的進一步傳播。在耐藥性方面,APP對諸如四環素、青霉素和甲氧芐啶磺酰胺等抗生素的耐藥性增加,但廣譜抗生素頭孢曲松、頭孢哌酮和哌拉西林等對該菌依然有效[14,15],使得該病在確診后能得到有效的控制。有研究表明,豬的上皮細胞分泌的一種抗菌肽防御素β2能夠增強豬對APP的抵抗力,為在治療PCP上減少抗生素的使用提供了新思路[16]。防控該病最重要的還是養豬場內避免引入攜帶新血清型菌株的豬,從源頭上阻斷感染源[13]。

4 小結

本病例診斷結果可見,死亡豬的肺臟等臟器中分離出的細菌鑒定為APP,血清型為7型;大體剖檢可見胸腔積液和肺臟出血,組織病理學觀察結果顯示出血性纖維素性肺炎,均符合PCP的大體病變和組織病理學特征。因此,此病例確診為PCP。