骨髓細(xì)胞學(xué)在犬血液腫瘤診斷中的應(yīng)用

馮如意 , 張艷桃,2 , 張怡雯 , 李 冬 , 張 璇 , 陳凱旋 , 姚 華

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 , 北京 昌平 102206 ; 2. 北京月壇寵物醫(yī)院 , 北京 西城 100045)

血液系統(tǒng)惡性腫瘤是一類(lèi)發(fā)生于造血系統(tǒng)、組織和器官的惡性腫瘤性疾病,又叫“血液腫瘤”(Hematological malignancies)。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)血液腫瘤分類(lèi)方案中根據(jù)細(xì)胞系來(lái)源將血液腫瘤分為四大類(lèi)別,分別是髓系腫瘤、淋巴組織腫瘤、肥大細(xì)胞腫瘤、組織細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤,不同腫瘤類(lèi)型的臨床表現(xiàn)、診斷依據(jù)和治療方案均各不相同[1]。

近年來(lái),寵物的血液腫瘤疾病備受關(guān)注,如腫瘤的骨髓轉(zhuǎn)移、多發(fā)性骨髓瘤、骨髓異常增生綜合征(Myelodysplastic syndrome,MDS)、急性粒細(xì)胞白血病(Acute myeloid leukemia,AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)等時(shí)有發(fā)生。血液腫瘤的病因和具體機(jī)制目前尚待深入研究,在人類(lèi)醫(yī)學(xué)和動(dòng)物醫(yī)學(xué)的臨床診斷和治療中均有很大挑戰(zhàn)。Bennett等研究發(fā)現(xiàn),ALL患犬治療后的中位生存期為55 d,明顯高于未治療患犬(7.5 d)[2]。Davis等對(duì)35例AML患犬進(jìn)行分組治療后發(fā)現(xiàn),及時(shí)有效的治療可使患犬中位生存期達(dá)到58 d[3]。可見(jiàn),血液腫瘤病例經(jīng)治療后能夠明顯提高患犬生存期。因此,找到快速、準(zhǔn)確的診斷方法對(duì)確診血液腫瘤的性質(zhì)以及采用最適宜的治療方案至關(guān)重要,有利于延長(zhǎng)寵物壽命,提高其生活質(zhì)量。然而,在我國(guó)明確診斷血液腫瘤疾病相對(duì)困難,出現(xiàn)異常征象時(shí)通過(guò)常規(guī)的臨床診斷方法尚難以解釋。借鑒人類(lèi)臨床血液疾病常采用的骨髓穿刺術(shù),提取患者的骨髓液進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查,可進(jìn)行血液疾病的初步診斷[4]。進(jìn)一步利用骨髓穿刺技術(shù)進(jìn)行涂片鏡檢,分析并判讀骨髓中細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量的變化是診斷血液腫瘤疾病的關(guān)鍵。趙曉云等通過(guò)外周血常規(guī)檢查結(jié)合骨髓穿刺涂片技術(shù)及時(shí)準(zhǔn)確地從23例新生患兒中診斷出了5例AML患者[5];白蕊等從300例常見(jiàn)白血病患者中,檢出了187例AML、47例ALL、30例慢性淋巴細(xì)胞白血病(Chronic lymphoblastic leukemia,CLL)和36例慢性粒細(xì)胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML),證實(shí)骨髓細(xì)胞形態(tài)檢查結(jié)合外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查對(duì)于診斷和鑒別診斷血液腫瘤價(jià)值較高,結(jié)果可靠[6]。目前,骨髓細(xì)胞學(xué)在寵物臨床中的研究和應(yīng)用罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,因此,本試驗(yàn)擬探討骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)在犬血液腫瘤病例中的初步應(yīng)用,為寵物臨床血液腫瘤疾病的診療提供研究和應(yīng)用依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 病例于2019—2021年采集自北京、天津和唐山等多家動(dòng)物醫(yī)院,經(jīng)病史調(diào)查、臨床癥狀觀察等初步診斷為犬血液腫瘤的疑似病例,直接轉(zhuǎn)診到北京月壇寵物醫(yī)院。經(jīng)動(dòng)物主人同意和授權(quán)、臨床執(zhí)業(yè)獸醫(yī)師進(jìn)行適應(yīng)癥評(píng)估后建議進(jìn)行骨髓穿刺檢查,樣本病例共計(jì)21例。

1.2 主要儀器和耗材 五分類(lèi)血細(xì)胞分析儀,型號(hào)ProCyte DX,購(gòu)自愛(ài)德士緬因生物制品貿(mào)易(上海)有限公司;奧林巴斯光學(xué)顯微鏡,型號(hào)CX 33,購(gòu)自上海普赫光電科技有限公司;骨髓穿刺針,型號(hào)1.6×30 XD,購(gòu)自淄博明遠(yuǎn)工貿(mào)有限公司;5 mL一次性使用無(wú)菌注射器、載玻片和蓋玻片,均購(gòu)自常州悅康醫(yī)療器材有限公司;多咪靜,規(guī)格10 mL,購(gòu)自碩騰(上海)企業(yè)管理有限公司;瑞-吉氏染色液,購(gòu)自北京中生瑞泰科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 問(wèn)診和體格檢查 問(wèn)診患犬的年齡、性別、體重和病史,并記錄;檢查患犬的精神狀態(tài)、營(yíng)養(yǎng)程度、被毛和皮膚狀態(tài)、可視黏膜顏色和淺表淋巴結(jié)等情況,分別進(jìn)行體況評(píng)分(Body condition score,BCS)。BCS是通過(guò)觀察和觸摸犬的骨骼、皮下脂肪厚度和肌肉厚實(shí)程度、腹圍大小、腹壁皺褶、腰部輪廓等情況,對(duì)犬的體況進(jìn)行9分制的評(píng)分[7]。1～3分代表偏瘦,4～6分代表正常,7～9分代表偏胖。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查 結(jié)合臨床癥狀和病史選擇必要的檢查,包括血常規(guī)、血涂片白細(xì)胞分類(lèi)計(jì)數(shù)、計(jì)數(shù)100個(gè)白細(xì)胞中各細(xì)胞成分所占比例、100個(gè)白細(xì)胞以外的異常細(xì)胞形態(tài)描述和數(shù)量的常規(guī)細(xì)胞學(xué)檢查等,記錄檢查結(jié)果,并進(jìn)行凝血試驗(yàn),檢測(cè)患犬凝血功能是否正常。

1.3.3 影像學(xué)檢查 根據(jù)需要,對(duì)患犬進(jìn)行相應(yīng)的X線攝影和超聲檢查,記錄檢查結(jié)果。

1.3.4 骨髓穿刺檢查 患犬全身麻醉,于肱骨近端觸摸到肱骨大結(jié)節(jié)后,將骨髓穿刺針插入結(jié)節(jié)遠(yuǎn)端的肱骨近端的側(cè)面扁平區(qū)域內(nèi)抽取骨髓液,制作骨髓涂片后進(jìn)行瑞-吉氏染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察骨髓細(xì)胞形態(tài),先用低倍鏡觀察再用油鏡觀察,進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)判讀,計(jì)數(shù)200個(gè)有核細(xì)胞,并記錄各類(lèi)細(xì)胞所占比例,根據(jù)國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)和FAB分型(French-American-British classification systems)進(jìn)行分型[8]。

2 結(jié)果

2.1 一般檢查 21例患犬病例中,公犬13只(61.9%),母犬8只(38.1%);最小年齡為2歲,最大年齡為14歲,平均年齡為(8.1±3.5)歲(圖1);平均體重為(9.7±3.7)kg;BCS在1～3分的3例(14.3%),4～6分的15例(71.4%),7～9分的3例(14.3%)(圖2)。

圖1 21例患犬病例年齡統(tǒng)計(jì)Fig.1 Age statistics of 21 canine cases

圖2 21例患犬病例體況評(píng)分統(tǒng)計(jì)Fig.2 BCS statistics of 21 canine cases

2.2 實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢查和影像學(xué)檢查 血常規(guī)檢查結(jié)果顯示,21例患犬病例中19例(90.5%)紅細(xì)胞(Red blood cell,RBC)總數(shù)降低(<6.54×1012/L),2例(9.5%)在正常范圍內(nèi)(6.54×1012～8.52×1012/L);18例(85.7%)白細(xì)胞(White blood cell,WBC)總數(shù)升高(>17.02×109/L),1例(4.8%)降低(<2.87×109/L),2例(9.5%)在正常范圍內(nèi)(2.87×109～17.02×109/L);9例(42.9%)血小板(Platelet,PLT)降低(<148 K/μL),12例(57.1%)在正常范圍內(nèi)(148～484 K/μL)(圖3)。

圖3 21例患犬病例血常規(guī)檢查結(jié)果Fig.3 Blood routine examination results of 21 canine cases

血涂片檢查于顯微鏡下觀察可見(jiàn):異常細(xì)胞病例中,3例(14.3%)原始和早幼粒細(xì)胞增多,5例(23.8%)原始和幼稚淋巴細(xì)胞增多,2例(9.5%)成熟淋巴細(xì)胞增多,2例(9.5%)全血細(xì)胞減少(圖4)。

圖4 21例患犬病例血涂片檢查結(jié)果Fig.4 Blood smear examination results of 21 canine cases

臨床觸診和影像學(xué)檢查結(jié)果顯示,6例患犬病例(28.6%)全身或腹腔等處淋巴結(jié)腫大,淋巴結(jié)穿刺細(xì)胞學(xué)涂片鏡檢可見(jiàn)大量淋巴瘤細(xì)胞,50%以上為胞體大的原始和幼稚淋巴細(xì)胞,少量為胞體小的淋巴細(xì)胞,易見(jiàn)巨噬細(xì)胞,少量中性粒細(xì)胞,未見(jiàn)細(xì)菌,疑為淋巴瘤;3例患犬病例(14.3%)分別在腹部、鼻鏡、頸部和左前肢發(fā)現(xiàn)疑似腫物,血涂片可見(jiàn)肥大細(xì)胞,腫物穿刺細(xì)胞學(xué)鏡檢可見(jiàn)大量圓形細(xì)胞,細(xì)胞核質(zhì)界限不清,核質(zhì)比較高,細(xì)胞內(nèi)充滿(mǎn)嗜堿性顆粒,并多見(jiàn)脫顆粒現(xiàn)象,易見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞,初步診斷為肥大細(xì)胞瘤(Mast cell tumor,MCT),可進(jìn)一步采用骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)判斷是否發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移。21例患犬病例的血涂片檢查細(xì)胞異常變化結(jié)果見(jiàn)圖4。

2.3 骨髓穿刺檢查 犬的大致正常骨髓象如表1所示。在對(duì)21例患犬病例骨髓有核細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類(lèi)和形態(tài)判讀后,結(jié)合相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)和FAB分型,將其診斷為造血系統(tǒng)腫瘤和非造血系統(tǒng)腫瘤兩大類(lèi)[9]。其中造血系統(tǒng)腫瘤18例(85.7%),包括5例ALL、2例CLL、6例淋巴瘤、3例AML和2例MDS;非造血系統(tǒng)腫瘤3例(14.3%),均為肥大細(xì)胞瘤的骨髓轉(zhuǎn)移,即肥大細(xì)胞白血病(Mast cell leukemia,MCL)。具體診斷結(jié)果見(jiàn)表2,診斷結(jié)果未全部列出,僅列出14例典型病例;淋巴瘤病例均為大致正常骨髓象,未發(fā)現(xiàn)骨髓轉(zhuǎn)移現(xiàn)象,僅列出1例為代表。

表1 犬的大致正常骨髓象Table 1 Generally normal myelogram in dogs

表2 典型病例患犬骨髓穿刺細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果Table 2 Cytological diagnosis results of bone marrow aspiration in typical cases

3 討論

3.1 犬血液腫瘤發(fā)生的病因分析 本試驗(yàn)中21例患犬病例年齡分布于2～14歲各階段,平均年齡為8.1歲,8～12歲占比較多。一般認(rèn)為,腫瘤疾病是中老年動(dòng)物的常發(fā)疾病,且隨著人們生活水平和獸醫(yī)技術(shù)水平的不斷提高,動(dòng)物的生存壽命不斷延長(zhǎng),腫瘤的發(fā)病率也隨之增加,這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。性別上,公犬占61.9%,母犬占38.1%,公犬占比更大,此結(jié)果與楊敏等[10]報(bào)道的ALL和CLL等腫瘤的發(fā)病均無(wú)性別傾向不一致,考慮到本試驗(yàn)所收集的病例受多重因素影響,包括病例來(lái)源、數(shù)量、飼養(yǎng)狀況和生活環(huán)境等,因此還有待進(jìn)一步增加樣本數(shù)量再進(jìn)行分析。21例患犬病例的BCS分布于2～9分,大多數(shù)(71.4%)處于4～6分,表明患犬的體況大多是正常的。本試驗(yàn)患犬的基本信息分析表明,血液系統(tǒng)腫瘤疾病的發(fā)生與犬的胖瘦程度無(wú)明顯關(guān)系,正常犬多發(fā),這與多種疾病在異常體況的動(dòng)物中多發(fā)不同,當(dāng)然不排除本試驗(yàn)結(jié)果受統(tǒng)計(jì)病例的來(lái)源和數(shù)量等局限性的影響。

本試驗(yàn)對(duì)寵物臨床收集到的21例患犬病例樣本的基礎(chǔ)信息進(jìn)行分析,結(jié)果顯示,造血系統(tǒng)腫瘤較非造血系統(tǒng)腫瘤更多,其中貧血和炎癥反應(yīng)為共同表現(xiàn),且多數(shù)患犬伴有RBC降低和WBC升高。有研究表明,貧血和腫瘤之間沒(méi)有明顯相關(guān)性,但多數(shù)腫瘤疾病臨床都會(huì)表現(xiàn)貧血的癥狀[11],與本試驗(yàn)結(jié)果一致。患犬表現(xiàn)出炎癥反應(yīng)且成熟的中性粒細(xì)胞增多,部分病例可見(jiàn)血小板減少,可能與腫瘤抗原引起的免疫介導(dǎo)性疾病有關(guān)。

3.2 多種細(xì)胞學(xué)技術(shù)在犬血液腫瘤診斷中的綜合應(yīng)用 在我國(guó)人類(lèi)醫(yī)學(xué)臨床和國(guó)外某些發(fā)達(dá)國(guó)家的動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床上,細(xì)胞學(xué)檢查是確診腫瘤性疾病的重要方法[12]。而我國(guó)小動(dòng)物臨床標(biāo)準(zhǔn)診療系統(tǒng)尚不完善,利用細(xì)胞學(xué)檢查對(duì)犬血液腫瘤進(jìn)行診斷的報(bào)道非常少見(jiàn)。有研究者通過(guò)體表淋巴結(jié)細(xì)針抽吸涂片診斷犬的淋巴肉瘤疾病,再通過(guò)組織活檢和免疫組化分型進(jìn)一步確認(rèn)淋巴肉瘤的細(xì)胞類(lèi)型,結(jié)合臨床血液生理生化檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行確診和針對(duì)性治療[13]。有研究者通過(guò)骨髓穿刺檢查和骨髓切片檢查確診了1例警犬的骨髓性白血病,結(jié)合細(xì)胞生化染色、流式細(xì)胞儀檢查和染色體檢查最終確認(rèn)了該白血病的具體類(lèi)型[14]。

應(yīng)用骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)可快速檢測(cè)患犬骨髓增生情況、骨髓細(xì)胞比例及其形態(tài)學(xué)變化,輔助血常規(guī)、血涂片等常規(guī)臨床檢查方法,可以確診造血系統(tǒng)和某些非造血系統(tǒng)腫瘤疾病,有利于及時(shí)對(duì)患犬施以最適宜的治療方案,提高其生活質(zhì)量,延長(zhǎng)其壽命。因此,骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)是寵物臨床血液腫瘤疾病診斷中的重要輔助,也是基層寵物醫(yī)院有能力實(shí)施的一項(xiàng)可提高血液病診斷準(zhǔn)確率的技術(shù)。對(duì)于臨床中犬血液腫瘤疾病,僅通過(guò)單一方法常常無(wú)法確診,需要多種細(xì)胞學(xué)技術(shù)的綜合應(yīng)用才能判斷疾病的性質(zhì)和分期,進(jìn)而制定科學(xué)的治療方案。基于目前骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)在人類(lèi)醫(yī)學(xué)臨床上的應(yīng)用及本試驗(yàn)對(duì)犬血液腫瘤診斷技術(shù)的初步應(yīng)用,綜合診斷技術(shù)可應(yīng)用于寵物臨床,協(xié)助臨床獸醫(yī)快速診斷血液腫瘤疾病,并對(duì)治療效果進(jìn)行觀察和分析,有助于寵物疾病的預(yù)后評(píng)價(jià)。由于骨髓細(xì)胞學(xué)技術(shù)在小動(dòng)物臨床屬于前沿性技術(shù),病例的收集受現(xiàn)實(shí)條件的影響,獲得的結(jié)果有限,后續(xù)我們將關(guān)注更多病例的臨床確診,對(duì)患犬的品種、既往病史和各類(lèi)血液腫瘤的發(fā)病率進(jìn)行更全面精準(zhǔn)的統(tǒng)計(jì),以期為臨床腫瘤的診斷提供更為可靠的借鑒。