雞胚源大腸桿菌的分離鑒定及其致病性和耐藥性分析

湯朝暉, 趙健超 , 任慧英 , 張 燦 , 鄒 玲 , 尹燕博 , 劉宗柱 , 劉文華

(1. 青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院 , 山東 青島 266109 ; 2. 青島農(nóng)業(yè)大學生命科學學院 , 山東 青島 266109)

大腸桿菌在環(huán)境中分布廣泛,致病血清型可以引起動物發(fā)病,是危害養(yǎng)禽業(yè)的重要病原菌,能夠單獨或協(xié)同其他病原混合感染[1],嚴重影響?zhàn)B殖效益。大腸桿菌既可以通過空氣、飼料和飲水等途徑水平傳播,也可以通過雞胚垂直傳播,雞胚感染大腸桿菌可造成孵化率降低或產(chǎn)生弱雛,混雜弱雛的雞苗是養(yǎng)殖場大腸桿菌感染的重要來源。大腸桿菌的致病性與所攜帶的毒力基因密切相關,毒力基因有助于大腸桿菌的定植、入侵和逃避免疫清除。大腸桿菌毒力基因種類眾多,報道較多的有菌毛基因papC、氣桿菌素基因iucD、鐵轉運基因irp2和抗血清存活基因iss等[2]。致病性大腸桿菌血清型眾多,疫苗針對性差,防治效果不顯著,所以抗生素治療仍是目前治療大腸桿菌病的主要方法。但長期使用抗生素所導致的耐藥性與日俱增,因此必須要增強對大腸桿菌耐藥性的監(jiān)測,合理使用抗生素,以減緩大腸桿菌耐藥性的發(fā)生[3]。為了解死胚中分離大腸桿菌的致病性,本試驗對啄殼死胚進行了大腸桿菌的分離,并對分離的大腸桿菌進行了致病性和耐藥性分析,揭示了毒力基因與大腸桿菌致病性的關系,旨在為種雞場防治大腸桿菌病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品、實驗動物和菌株 山東省某白羽肉雞孵化場采集的不同批次174枚啄殼未出殼死胚;SPF級 BALB/c小鼠,雄性,6～8周齡,體重(20±2)g,購自青島大吳富城科技有限公司(生產(chǎn)許可證號:913702853259697258);大腸桿菌K88、ATCC25922、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028,均為青島農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物學實驗室保存。

1.2 試驗試劑 SS瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美蘭培養(yǎng)基和大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,均購自青島海博生物技術有限公司;革蘭染色試劑盒,購自青島長和生物科技有限公司;2×TaqMaster Mix,購自上海派森諾生物科技股份有限公司;藥敏紙片,自制,并經(jīng)質控菌株ATCC25922驗證;細菌微量生化反應管,購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 主要儀器 PCR儀,杭州朗基科學儀器有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,上海旻泉儀器有限公司產(chǎn)品;生物安全柜,中國BIOBASE公司產(chǎn)品。

1.4 細菌的分離培養(yǎng) 用75%酒精消毒待檢死胚蛋殼表面,用接種環(huán)挑取卵黃液和胎糞分別接種SS瓊脂培養(yǎng)基和伊紅美蘭培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)24 h,觀察結果。

1.5 分離菌的鑒定 將在SS瓊脂培養(yǎng)基上形成的邊緣整齊的粉紅色菌落和在伊紅美蘭培養(yǎng)基上形成的有金屬光澤的黑色菌落作為疑似大腸桿菌,進一步接種至大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,同時進行革蘭染色。挑取顯色培養(yǎng)基上的藍色菌落進行生化鑒定,包括吲哚試驗、甲基紅試驗、V-P試驗和枸櫞酸鹽利用試驗。

1.6 小鼠攻毒試驗 將大腸桿菌分離株分別接種LB培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)8 h,通過菌落計數(shù)測定菌液濃度,將BALB/c小鼠隨機分組,每組6只,其中試驗組小鼠分別腹腔注射1×108CFU/mL的分離株培養(yǎng)液0.5 mL[4],陽性對照組小鼠腹腔注射1×108CFU/mL的K88菌液0.5 mL,陰性對照組小鼠腹腔注射1×108CFU/mL的BL21菌液0.5 mL,空白對照組小鼠腹腔注射LB培養(yǎng)基0.5 mL。各組小鼠隔離飼養(yǎng),觀察攻毒后5 d內小鼠的臨床癥狀,及時剖檢全部死亡小鼠,觀察內臟病理變化,并從肝臟取樣接種至大腸桿菌顯色培養(yǎng)基。

1.7 大腸桿菌毒力基因的PCR測定 參照參考文獻[5,6]設計毒力基因irp2、iucA、iucD、fimA、fimC、papA、papC、iutA、tsh、fyuA、iss、coIV、eaeA和vat的PCR擴增引物,引物由華大基因有限公司合成。25 μL PCR反應體系包括:2×TaqMaster Mix 12.5 μL,DNA模板2 μL,上、下游引物各1 μL,ddH2O 8.5 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,46～56 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,30個循環(huán);72 ℃總延伸10 min,退火溫度根據(jù)引物不同進行選擇。對大腸桿菌分離株、大腸桿菌工程菌K88、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028進行上述14種毒力基因的PCR擴增。

1.8 藥敏試驗 選擇鏈霉素、慶大霉素、新霉素、安普霉素、大觀霉素、多西環(huán)素、恩諾沙星、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉和氨芐西林共10種抗菌藥物進行紙片擴散法藥敏試驗,具體操作和結果判定標準參照參考文獻[7]。藥敏試驗結果用軟件GraphPad Prism 6.0和Excel進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 分離菌的鑒定 將在SS瓊脂培養(yǎng)基上呈粉紅色、伊紅美蘭培養(yǎng)基上呈黑色帶金屬光澤、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上呈藍色的符合大腸桿菌生長特點的菌落進行革蘭染色,將革蘭染色陰性短桿菌且吲哚試驗和甲基紅試驗結果陽性、V-P試驗和枸櫞酸鹽利用試驗結果陰性者,判定為大腸桿菌,共獲得大腸桿菌分離株28株。分離菌株按阿拉伯數(shù)字順序進行編號,其中分離自卵黃的菌株以“E”和數(shù)字組合命名;分離自胎糞的菌株以“F”和數(shù)字組合命名。

2.2 小鼠攻毒試驗 結果如表1所示,觀察期內,空白對照組和陰性對照組小鼠無異常情況;陽性對照組小鼠全部死亡;試驗組除1株大腸桿菌分離株(F39)攻毒小鼠6只均正常存活外,其他試驗組小鼠均出現(xiàn)不同數(shù)量死亡,其中有8株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是100%,有16株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是83.3%,有1株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是66.7%,有2株大腸桿菌分離株對小鼠的致死率是50.0%;從試驗組和陽性對照組死亡小鼠肝臟取樣接種大腸桿菌顯色培養(yǎng)基,培養(yǎng)結果顯示,均獲得均勻一致的高純度藍色菌落。

表1 大腸桿菌小鼠攻毒試驗Table 1 Mouse inoculation test of Escherichia coli

2.3 大腸桿菌毒力基因的PCR測定 PCR擴增結果如表2所示,28株大腸桿菌攜帶irp2、iucA、iucD、fimA、fimC、iutA、tsh、fyuA、iss和coIV共10種毒力基因,總檢出率為71.4% (10/14);其中檢出率最高的毒力基因是fimC,檢出率為85.7%(24/28);另外9種毒力基因的檢出率介于3.6%(1/28)～64.3%(18/28)。papA、papC、eaeA和vat這4種毒力基因未檢出。本試驗還檢測了大腸桿菌K88、BL21和鼠傷寒沙門菌ATCC14028的毒力基因攜帶情況,K88檢測到9種毒力基因,BL21只檢測到了fimA和fimC兩種毒力基因,鼠傷寒沙門菌ATCC14028沒有檢測到上述毒力基因,說明這14種毒力基因是大腸桿菌獨有的。由表1和表2的結果可知,共有20株菌株攜帶了2種以上(3～6種)毒力基因,其中19株菌株的致死率在83.0%以上,表明大腸桿菌菌株毒力基因的攜帶數(shù)量與大腸桿菌的致死率大致呈正相關。

表2 28株大腸桿菌分離菌株攜帶的毒力基因Table 2 Virulence genes carried by 28 E. coli isolated strains

2.4 藥敏試驗 藥敏試驗統(tǒng)計結果如圖1所示,28株大腸桿菌分離株對10種抗菌藥物的敏感性差異較大,對多西環(huán)素(75.0%)、氟苯尼考(75.0%)、頭孢噻呋鈉(64.3%)、氨芐西林(89.3%)和鏈霉素(57.1%)耐藥率均超過50.0%,對恩諾沙星(50.0%)、新霉素(42.9%)、安普霉素(32.1%)、大觀霉素(17.9%)和慶大霉素(25.0%)耐藥率介于17.9%～50.0%。

圖1 大腸桿菌分離菌株對10種抗菌藥物的敏感性Fig.1 Sensitivity of E. coli isolated strains to 10 antibiotics

藥物的多重耐藥分析的雷達圖結果如圖2所示,通過比較分析不同大腸桿菌分離株對10種臨床常用抗菌藥物的耐藥情況可知,7耐和7耐以上有8株,占28.6%;5～6耐有11株,占39.3%;3～4耐有6株,占21.4%。由此可知,大腸桿菌分離株中5耐及5耐以上的菌株數(shù)量較多,多重耐藥現(xiàn)象明顯。

圖2 大腸桿菌分離菌株的多重耐藥性分析Fig.2 Multiple drug resistance analysis of E. coli isolated strains

3 討論

大腸桿菌的致病性與其攜帶的毒力基因具有緊密的相關性。致病性大腸桿菌感染宿主后,其攜帶的毒力基因之間相互協(xié)調,如黏附相關基因、大腸桿菌素基因、血清抗性相關基因和溫度敏感性相關基因表達,共同發(fā)揮致病作用,從而引起動物發(fā)病[8]。小鼠攻毒試驗結果顯示,有27株大腸桿菌分離株對小鼠有不同程度的致死性;毒力基因的PCR檢測結果顯示,不同菌株攜帶毒力基因的數(shù)量不一。fimC屬于Ⅰ型菌毛毒力基因,本試驗中fimC基因的檢出率為85.7%,與Janben等[9]和孟慶美等[10]對fimC基因的檢測結果一致;本試驗中大腸桿菌BL21和分離株F39沒有致病性,但都檢測到fimC基因,與王亞君等[11]報道的fimC基因幾乎只存在于高致病性大腸桿菌中有差異。iss和tsh是大腸桿菌的2個重要毒力基因,iss能夠提高細菌在宿主血清中的存活能力,tsh是黏附和蛋白水解相關的毒力基因,本試驗分離到含有這2種毒力基因的13株大腸桿菌中有12株對小鼠致死率在83.0%以上,與已有的研究結果一致[2,12-14]。iutA是細菌獲得鐵的重要毒力基因,能夠使細菌在低鐵環(huán)境下生長。本試驗分析結果顯示,致病性大腸桿菌至少含有3～6個與黏附、血清抗性、鐵攝取等相關的毒力基因。大腸桿菌毒力基因種類繁多,本試驗只對14種毒力基因進行了檢測,并不排除含有其他毒力基因的可能。此外,毒力基因檢測并不能作為判定大腸桿菌致病性的唯一標準,需要結合臨床動物試驗,亦有用雞胚接種來判定大腸桿菌致病性的報道[15]。

本試驗分離的28株大腸桿菌對多西環(huán)素、氟苯尼考、頭孢噻呋鈉、氨芐西林和鏈霉素的耐藥率較高且多重耐藥現(xiàn)象明顯,通過溯源了解到與種雞場在飼養(yǎng)過程中經(jīng)常使用這上述幾種抗菌藥物有關。

本試驗通過對雞胚源大腸桿菌致病性和耐藥性的分析,提示種雞場和孵化場應重視對雞場的日常管理和孵化器的消毒工作,盡可能減少環(huán)境中的大腸桿菌,降低雞胚大腸桿菌的攜帶率,從而提高雛雞健康水平。另一方面,雞場在應用抗菌藥物進行治療時,應結合藥敏試驗結果以提高治療效果。本試驗結果為種雞場加強飼養(yǎng)管理和針對耐藥性有選擇地使用替抗產(chǎn)品提供了參考依據(jù)。