生豬屠宰過程沙門菌污染狀況及其耐藥性傳播風險

劉云哲 , 趙 格 , 趙建梅 , 王 琳 , 楊騰騰 , 高玉斌 , 黃秀梅 , 張青青 ,張喜悅 , 劉俊輝 , 耿國芹 , 王君瑋 , 鄒 明

[1. 中國動物衛生與流行病學中心致病微生物監測室 , 農業農村部畜禽產品質量安全風險評估實驗室(青島) , 山東 青島 266032 ; 2. 青島農業大學動物醫學院 , 山東 青島 266109 ; 3. 臨沂市畜牧技術推廣站 , 山東 臨沂 276000]

在我國,由沙門菌引發的食源性疾病占到全國報告的食源性病例的70%～80%,其中,豬肉是最主要的歸因食品[1]。生豬養殖過程中,由于抗生素的不規范大量使用,細菌耐藥現象持續增加,并且隨著生豬進入屠宰鏈,促使細菌耐藥基因水平傳播,從而造成屠宰環節中豬肉的耐藥細菌污染問題日益嚴重。據Wang 等[2]報道,豬肉被耐藥細菌污染的風險最高可達59%,這也對消費者的健康造成嚴重威脅。

多位點序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)方法由于其可重復性好、可比性強,常用于對細菌進化分析和分子流行病學調查研究[3,4]。與脈沖場凝膠電泳(Pulsed-field gel electrophoresis,PFGE)相比,MLST更適于菌株的進化關系和微生物群體遺傳學分析,可用于廣義的流行病學研究[5]。

為評估沙門菌污染及其耐藥對生豬屠宰過程豬肉產品的風險,本試驗對山東省生豬屠宰場沙門菌的污染和耐藥性情況進行采樣檢測,并通過分離菌株耐藥狀況和MLST溯源分析,進一步厘清不同規模生豬屠宰場、不同樣品類型、屠宰不同環節的沙門菌污染和危害風險狀況,為屠宰企業采取有效的風險控制措施提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2020年于山東省5個代表性生豬屠宰場(3個大型屠宰場:日屠宰量1 000頭以上;2個中小型屠宰場:日屠宰量1 000頭以下)采集棉拭子樣品共552份(大型屠宰場:340份;中小型屠宰場:212份)。其中包括肛拭子106份、屠宰環境拭子(包括工人手部、屠宰間地面和屠宰器具)138份、水樣品27份和屠宰環節豬肉胴體拭子281份(包括剝皮后沖淋前、剝皮后沖淋后、燙煺毛后沖淋前、燙煺毛后沖淋后、凈膛后沖淋前、凈膛后沖淋后、預冷前和預冷后)。

1.1.2 主要材料 細菌瓊脂粉和哥倫比亞血瓊脂培養基(北京陸橋技術股份有限公司),沙門菌顯色培養基[法國科瑪嘉(The Chromogenic Media Pionner)公司],胰蛋白胨大豆肉湯(Trypticase soy broth,TSB)、緩沖蛋白胨水(Buffered peptone water,BPW)和亞硒酸鹽胱氨酸(Selenite cystine,SC)增菌液(青島高科技工業園海博生物技術有限公司),基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)檢測配套試劑(鄭州安圖生物工程股份有限公司),GoTaq?Green Master Mix和DNA Marker DL2 000[寶日醫生物技術(北京)有限公司],BIOWEST西班牙瓊脂糖(上海仝元生物科技有限公司),BIOFOSUN革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板(上海星佰生物技術有限公司),美國Biotium GelRed核酸凝膠染料和50×TAE核酸電泳緩沖液(上海索橋生物科技有限公司)。

大腸桿菌標準菌株 (ATCC 25922),購自中國獸醫藥品監察所。

1.1.3 主要儀器和設備 MALDI-TOF質譜儀(鄭州安圖生物工程股份有限公司),快速渦勻器(中外合資深圳天南海北有限責任公司);生物安全柜(萬心順昌科技有限公司);電熱恒溫水浴鍋(DK-98-1)(天津市泰斯特儀器有限公司);恒溫培養箱(上海艾朗儀器有限公司);PCR 儀(杭州博日 BIOER GeneMax PCR 基因擴增儀、賽默飛 Thermo Arktik 多功能 PCR 儀);凝膠成像分析儀(Tanon 2500 BR)(上海天能科技有限公司);電泳儀(北京六一儀器廠);移液器(德國艾本德股份公司)。

1.2 菌株分離培養和鑒定 按照國家標準《食品微生物學檢驗》(GB4789.4—2016)[6]進行細菌的分離和鑒定。將采集的樣本接入BPW預增菌液中,37 ℃恒溫培養箱中孵育12～24 h。取200 μL預增菌液加入SC增菌液中,37 ℃培養24 h。用接種環蘸取增菌液接種于沙門菌顯色培養基中,37 ℃培養24 h。挑選紫色的可疑單菌落,再次接種于沙門菌顯色培養基中進行純化。利用MALDI-TOF MS對篩選出的可疑菌落進行鑒定。

1.3 藥敏試驗 根據美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)標準[7],采用微量肉湯稀釋法測定分離獲得沙門菌的藥物敏感性,根據BIOFOSUN革蘭陰性需氧菌藥敏檢測板說明書對藥敏板結果進行判讀,同時以大腸桿菌(ATCC 25922)作為陽性對照,得到最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration,MIC)值,獲得相應的敏感、中度敏感和耐藥結果。

共檢測14種抗菌藥物的敏感性,分別是青霉素類:氨芐西林(Ampicillin,AMP)、奧格門丁(阿莫西林/克拉維酸,Amoxicillin-Clavulanic acid,A/C)、美羅培南(Meropene M,MEM);頭孢類:頭孢噻呋(Ceftiofur,CEF)、頭孢他啶(Ceftazidime,CAZ);氨基糖苷類:慶大霉素(Gentamicin,GEN)、大觀霉素(Spectinomycin,SPT);四環素類:四環素(Tetracycline,TET);酰胺醇類:氟苯尼考(Florfenicol,FFC);磺胺類:復方新諾明(甲氧芐啶/磺胺甲噁唑:Sulfamethoxazole-Trimethoprim,SXT)、磺胺異噁唑(Sulfafurazole,SF);氟喹諾酮類:恩諾沙星(Enrofloxacin,ENR)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL);其他:黏桿菌素(Colistin,CL)。

1.4 多位點序列分型 將屠宰環節分離獲得的沙門菌進行MLST試驗。根據 MLST 網站(https://pubmlst.org/databases/)提供的用于沙門菌 MLST試驗的7對管家基因(aroC、dnaN、hemD、hisD、purE、sucA和thrA)設計引物序列(表1),并送至北京擎科生物公司進行引物合成。應用熱裂解法提取DNA,無菌條件下,吸取1 mL選擇性增菌液于1.5 mL無菌EP管中,10 000 r/min離心5 min,棄上清,加入80 μL DEPC水懸浮沉淀,煮沸10 min,冰浴5 min,12 000 r/min離心5 min,收集上清即為DNA。PCR反應體系為25 μL:GoTaq?Green Master Mix 12.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板1 μL,無核酸酶水 9.5 μL;反應程序參照表2。

表1 沙門菌7個管家基因的引物序列Table 1 Primer sequences of seven housekeeping genes in Salmonella

表2 沙門菌7個管家基因的PCR反應程序Table 2 PCR reaction programs for seven housekeeping genes of Salmonella

PCR擴增產物送北京擎科生物科技股份有限公司測序,用MegAlign、EdiSeq軟件讀取測序結果,置于數據庫(https://pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst _salmonella_seqdef&page=batchSequenceQuery)查詢每個等位基因的數值序號,最終7個序號輸入到網址(https:// pubmlst.org/bigsdb?db=pubmlst_salmonella_seqdef&page=profiles)中確定每個菌株的ST型。

1.5 數據處理 利用SPSS軟件分析耐藥性檢測結果。通過卡方檢驗,分析不同規模、不同屠宰拭子、不同屠宰環節拭子中的沙門菌在耐藥性和多重耐藥性方面的差異,P<0.01表示極顯著性差異,P<0.05表示顯著性差異,具有統計學意義。使用BioNumerics 7.6 軟件對沙門菌的MLST結果進行聚類分析,以Categorical 法計算相似性系數,構建最小生成樹,探討不同ST型菌株間的親緣關系。

2 結果

2.1 沙門菌污染狀況分析 經細菌分離培養和鑒定,共獲得58株沙門菌(10.5%,58/552)。大型屠宰場(7.4%,25/340)沙門菌檢出率明顯低于中小型屠宰場(15.6%,33/212),存在顯著性差異(P=0.02<0.05)(圖1)。不同種樣品類型中肛拭子檢出率最高,為15.1%(16/106),屠宰過程中豬肉胴體拭子沙門菌檢出率為10.0%(28/281),屠宰環境拭子沙門菌檢出率為10.1%(14/138),水樣品中未檢出沙門菌(圖2)。

圖1 不同規模屠宰場拭子樣品中沙門菌檢出率Fig.1 Salmonella detection rates in different swab samples from slaughterhouses of different scale

圖2 不同類型拭子樣品中沙門菌檢出率Fig.2 Salmonella detection rates in different types of swab samples

不同屠宰環節豬肉胴體拭子樣品中,剝皮后沖淋后環節沙門菌檢出率最低(2.5%,1/40),預冷前環節檢出率最高(26.7%,8/30),其次依次是凈膛后沖淋前(12.7%,7/55)、凈膛后沖淋后(11.8%,6/51)、燙煺毛后沖淋前(10.0%,1/10)、剝皮后沖淋前(7.5%,3/40)、預冷后(5.7%,2/35)、燙煺毛后沖淋后(5.0%,1/20);預冷前豬肉胴體沙門菌檢出率與剝皮后沖淋前(P=0.03)、剝皮后沖淋后(P=0.03)、預冷后(P=0.02)各環節之間有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。

圖3 不同屠宰環節豬肉胴體拭子樣品的沙門菌檢出率Fig.3 Salmonella detection rates in swab samples of pork carcass at different slaughtering stages剝皮后沖淋前、剝皮后沖淋后、預冷后拭子樣品分別與預冷前拭子樣品比較,*:P<0.05The swab samples after peeling and before rinsing,after peeling and rinsing, after pre-cooling were compared with the swab samples before pre-cooling,*:P<0.05

2.2 沙門菌分離株耐藥性分析 58株沙門菌對14種抗菌藥物中耐藥率最高的為AMP(96.6%);其次為TET和SF(94.8%);對SXT、SPT和FFC的耐藥率均高于89.0%,但對A/C、CEF、CAZ、MEM和CL較為敏感(表3)。

表3 58株沙門菌分離株的耐藥性分析Table 3 Drug resistance analysis of 58 Salmonella isolates

2.2.1 不同規模屠宰場沙門菌分離株耐藥性分析 沙門菌分離株對FFC(P=0.02)、SF(P=0.04)、SXT(P=0.01)、CEF和A/C(P=0.04)5種抗菌藥物的耐藥率在不同規模(大型和中小型)屠宰場間存在顯著性差異(P<0.05);對其他抗菌藥物的耐藥率在不同規模屠宰場間差異不顯著(P>0.05)(圖4)。

圖4 不同規模生豬屠宰場沙門菌分離株的耐藥率比較Fig.4 Comparison of drug resistance rates of Salmonella isolates from slaughterhouses of different scale同一藥物在大型屠宰場與中小型屠宰場的耐藥率比較,*:P<0.05Comparison of drug resistance rates between large and small and medium-scale slaughterhouses for the same drug,*:P<0.05

2.2.2 不同類型樣品沙門菌分離株耐藥性分析 不同類型樣品(肛拭子、豬肉胴體拭子、屠宰環境拭子)沙門菌分離株的耐藥率結果如表4所示。MEM抗菌藥物耐藥率在豬肉胴體拭子樣品和屠宰環境拭子樣品中有顯著性差異(P=0.04),其他藥物的耐藥率在各種類型樣品中無顯著性差異(P>0.05)(圖5)。將屠宰環境中的屠宰器具拭子、工人手部拭子和屠宰間地面拭子的耐藥情況進行差異性比較,結果顯示,MEM和CL在工人手部與屠宰器具中表現出顯著性差異(P=0.03<0.05),其他藥物耐藥率在工人手部、屠宰見地面、屠宰器具中無顯著性差異(P>0.05)(圖6)。

圖5 不同類型樣品沙門菌分離株的耐藥率比較Fig.5 Comparison of drug resistance rates of Salmonella isolates from different sample types豬肉胴體拭子與屠宰環境拭子對MEM的耐藥率比較,*:P<0.05Comparison of resistance rates to MEM between pork carcass swabs and slaughtering environment swabs,*:P<0.05

圖6 屠宰環境不同類型拭子樣品沙門菌分離株的耐藥率比較Fig.6 Comparison of drug resistance rates of Salmonella isolates from different types of swab samples in the slaughter environment工人手部與屠宰器具拭子對MEM和CL的耐藥率比較,*:P<0.05Comparison of resistance rates to MEM and CL in swabs of workers' hands and slaughter equipment,*:P<0.05

表4 不同類型樣品沙門菌分離株的耐藥率Table 4 Drug resistance rates of Salmonella isolates in different sample types

2.2.3 屠宰過程不同環節沙門菌分離株耐藥性分析 燙煺毛后沖淋后(100%,1/1)和預冷前(0%,0/8)環節對CEF的耐藥率有顯著性差異(P=0.008<0.05),燙煺毛后沖淋后與凈膛后沖淋后環節對OFL的耐藥率有顯著性差異(P=0.008<0.05),燙煺毛后沖淋后(100%,1/1)與凈膛后沖淋前(0%,0/7)(P=0.005<0.05)、凈膛后沖淋后(0%,0/6)(P=0.008<0.05)、預冷前(0%,0/8)(P=0.008<0.05)對CL的耐藥率表現出顯著性差異(P<0.05)(圖7)。

圖7 生豬屠宰各環節沙門菌分離株的耐藥率比較Fig.7 Comparison of drug resistance rate of Salmonella isolates at various stages of pig slaughtering

2.3 沙門菌分離株多重耐藥性分析 58株沙門菌分離株中多重耐藥(≥3)菌株為56株,多重耐藥率為 96.6%(56/58)。5耐菌株數最多,為40株(69.0%,40/58);其次為 6耐,共10株(17.2%,10/58)(圖8)。在各屠宰環節拭子樣品中,多重耐藥菌株數最多的為預冷前,共8株(14.3%,8/56),其次為凈膛后沖淋前,共6株(10.7%,6/56)。中小型屠宰場的多重耐藥率(58.9%,33/56)高于大型屠宰場(41.1%,23/56)(P=0.007)。屠宰豬肉胴體拭子(46.4%,26/56)和肛拭子(28.6%,16/56)分離株的多重耐藥率高于屠宰環境拭子(25.0%,14/56)。

圖8 生豬屠宰場沙門菌分離株多重耐藥性分析Fig.8 Analysis of multi-drug resistance in Salmonella isolates from pig slaughterhouse

2.4 沙門菌MLST分型 58株沙門菌共鑒定出6個ST型,分別為ST19、ST40、ST469、ST358、ST155和ST34。其中ST40(n=26)為主要流行ST型,其次是ST19(n=11)、ST155(n=9)、ST469(n=7)和ST358(n=4),ST34僅有1株。

不同規模屠宰場的分離株的最小生成樹聚類分析結果如圖9A所示,ST19在大型和中小型屠宰場中共有11株,其中10株(90.9%,10/11)來自大型屠宰場;ST40共26株,其中僅7株(26.9%,7/26)來自大型屠宰場。可見,ST19是大型屠宰場的優勢型,ST40是中小型屠宰場的優勢型。不同類型樣品的分離株的聚類分析結果如圖9B所示,ST19多數(72.8%,8/11)來自肛拭子;ST19、ST40和 ST358在肛拭子、豬肉胴體拭子和屠宰環境拭子三類不同樣品中均存在。可見,屠宰過程沙門菌存在垂直接觸傳播的風險。屠宰不同環節樣品的分離株的聚類分析結果如圖9C所示,ST19和ST34來自剝皮后沖淋前后環節;ST40在燙煺毛環節(2/15,13.3%)開始存在,隨后在凈膛環節(11/15,73.3%)、預冷環節(2/15,13.3%)均有檢出;ST155在凈膛后開始存在,在隨后各環節一直存在。

圖9 生豬屠宰過程沙門菌分離株基因型聚類分析Fig.9 Gene typing cluster analysis of Salmonella isolates during pig slaughteringA:不同規模屠宰場拭子樣品; B:不同類型拭子樣品; C:不同屠宰環節拭子樣品每個圓圈代表一種 ST,粗實線表示2個ST型相差1個等位基因,虛線表示2個ST型相差3個及以上等位基因A: Different scale slaughterhouse swab samples; B: Different types of swab samples; C: Swab samples from different slaughtering stagesEach circle represents an ST, thick solid lines indicate a difference of one allele between two ST types, dashed lines indicate a difference of three or more alleles between two ST types

3 討論

本試驗通過對不同規模生豬屠宰場各樣品中沙門菌污染及其耐藥狀況進行監測,以期明晰導致豬肉污染的主要致病微生物及其耐藥性在屠宰過程的傳播規律,為屠宰環節豬肉微生物風險防控提供指導。本試驗監測結果顯示,屠宰環節沙門菌的總陽性檢出率為10.5%,其中肛拭子檢出率為15.1%、豬肉胴體拭子檢出率為10.0%、屠宰環境拭子檢出率為10.1%;與酒躍光[8]報道的生豬屠宰場沙門菌總檢出率(13.30%)、屠宰環境樣品檢出率(8.9%～15.2%)和屠宰胴體檢出率(9.1%～14.5%)的調查數據差異不大;與謝建華等[9]屠宰環節(7.27%)的調查數據較接近;低于劉鮮鮮等[10](32.67%)和黃秀梅等[11](20.14%)的屠宰胴體檢出率,這說明屠宰企業、采樣量、屠宰環節的不同,沙門菌污染情況也會出現一定程度的差異;此外,生豬的來源和本身的帶菌量也是造成這種差異的原因。本試驗肛拭子檢出率較高,說明可能待宰豬體本身攜帶致病菌;同時環境樣品和凈膛環節、預冷前環節沙門菌污染較為嚴重,在屠宰過程中凈膛環節可能會造成內臟破裂進而污染胴體,而且屠宰環節中的器具等屠宰環境與胴體直接接觸增加了交叉污染的概率。因此,在生豬屠宰環節應加強對器具等清洗和消毒的次數,對屠宰過程中的人員操作也應嚴格把控,防止通過工人手、器具等污染環境和胴體。

抗生素的廣泛使用和濫用導致沙門菌等對抗菌藥物的耐藥情況也日益嚴重[12],世界各地報道多重耐藥沙門菌的分離率也越來越高[13]。本試驗結果顯示,沙門菌對氨芐西林(96.6%)、四環素(94.8%)、磺胺異噁唑(94.8%)的耐藥率較高;氨芐西林的耐藥率結果高于曹正花等[14](80.77%)、方忠意等[15](73.33%)和王娟等[16](51.68%)的耐藥結果,四環素耐藥率結果高于張金飛[17](80%)、賀恒旭等[18](72.61%)和劉雪杰等[19](67.88%)的研究結果。另外,多黏菌素作為治療革蘭陰性菌的最后一道防線[20],且頭孢他啶屬于人用頭孢菌素[18],但此次結果數據中均表現一定程度的耐藥。說明在生豬養殖環節存在一定程度的不規范用藥,因此必須采取多種監管和控制措施以降低耐藥沙門菌的出現,對于抗菌藥物的使用要給予足夠的重視。

本試驗結果顯示,豬肉樣品中ST19和ST40是最主要的基因型。倪培恩[21]對上海的豬肉樣品的檢測結果顯示,ST40廣泛存在于豬肉樣品中;蔡銀強[22]在揚州市生豬屠宰場、零售豬肉和人源沙門菌分離株中發現ST40基因型存在較為普遍,沙門菌可通過屠宰鏈向人類進行傳播;酒躍光[8]發現,生豬屠宰場的ST型分布主要是ST40(48.8%)、ST469(27.7%) 和ST34(13.2%),屠宰環節樣品中也出現這3種ST型,而且ST19 和 ST34 沙門菌可以引發人類和動物的沙門菌病,給臨床治療帶來困難[23,24],同時常表現出有較高的致死率,這也是國內外研究人員關注的問題[25-27]。在本次試驗中發現,菌株ST型為ST19和ST34的沙門菌多數都對氨芐西林、四環素和磺胺類藥物耐藥,也有少數菌株對黏菌素和頭孢他啶耐藥;不同規模、不同樣品類型、不同屠宰環節中,優勢ST型一直存在,說明沙門菌在整個屠宰鏈中存在水平傳播,而且胴體與環境之間交叉傳播的風險較嚴重。

綜上所述,生豬屠宰企業應加強對待宰豬來源的管控,加強對屠宰環境的消毒,嚴格管控各屠宰環節,特別是燙煺和凈膛環節,以防引入致病微生物風險并通過下游食物鏈傳播給人類,對人類健康造成威脅。