大蒜素對雞皮刺螨的驅避活性

盧晨陽 , 趙 聰 , 菅憶晨 , 岳治光 , 菅復春 , 寧長申

(1. 河南農業大學動物醫學院 , 河南 鄭州 450002 ; 2. 河南安進生物技術股份有限公司 , 河南 鄭州 450003)

雞皮刺螨(Dermanyssusgallinae)屬于節肢動物門(Arthropoda),蛛形綱(Arachnida),蜱螨目(Acarina),刺皮螨科(Dermanyssidae),是雞場中一種常見的體外寄生蟲,亦可侵襲其他動物和人類。雞皮刺螨常在夜晚時爬到雞體上并吸食血液,每次吸血持續0.5～1.5 h[1],影響雞只休息,引發雞只騷動不安和打斗,導致貧血、生長性能下降和產蛋下降,甚至死亡[2]。同時雞皮刺螨還能傳播多種病原體,導致雞痘、新城疫、禽霍亂、禽副傷寒和禽螺旋體病等[3],產生較嚴重危害。目前,防治雞皮刺螨的主要方法是噴灑化學殺蟲劑,如有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸脂類殺蟲劑等。但用藥時間常多于白天,此時雞皮刺螨多隱藏在籠子和墻體的縫隙中以及料槽表面,同時由于雞皮刺螨繁殖能力強且雞羽毛具有疏水性,導致藥物防控能力有限。因此亟需尋找一種新型防治雞皮刺螨的方法。

大蒜素(Allicin)具有抗蟲作用,在農業生產中已有大量研究。噴灑大蒜提取物稀釋液能夠驅避和觸殺田間害蟲,包括蚜蟲、扁喙葉蟬、薊馬和花蕾蛆等[4,5]。大蒜素等植物次生代謝物質具有低毒、低殘留、易降解和環境友好等優點,可以作為化學殺蟲藥和驅避劑的替代品[6]。本試驗使用濾紙片法研究大蒜素對雞皮刺螨的驅避效果,以期篩選出天然雞皮刺螨驅避劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 雞皮刺螨樣品來源 雞皮刺螨由河南農業大學動物醫學院寄生蟲學實驗室保存,于2021年6月4日采自河南省衛輝市北董莊村某養雞戶的產蛋雞,經形態學和PCR鑒定為雞皮刺螨。選取成蟲于2021年6月20日—7月16日進行本試驗。

1.1.2 主要試劑和用品 大蒜素原料藥(98%),購自世紀奧科生物技術有限公司;無水乙醇、101濾紙、蒸餾水、遮光布和50 mm培養皿等。

1.1.3 主要藥物 0.5%、1.0%和3.0%大蒜素水乳劑(20200524)、0.5%、1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑(20200524)、1.0%驅蚊酯長效驅避劑(20200524),均為河南農業大學動物醫學院寄生蟲學實驗室與河南安進生物技術股份有限公司合作研制,直接噴霧使用。OFF驅蚊液為市售某公司產品,批號20200818AWPB,每瓶100 mL含避蚊胺7 g,距離皮膚15～20 cm直接噴霧使用。

1.2 方法

1.2.1 不同濃度大蒜素對雞皮刺螨的驅避活性 應用濾紙片法進行雞皮刺螨驅避試驗,試驗設計參考Greive等[7]的方法并稍作改進。加無水乙醇將大蒜素標準品配制成濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 mg/mL的大蒜素溶液。將101濾紙裁剪成直徑為50 mm的半圓形紙片,分別在上述濃度的大蒜素溶液中浸泡10 min后取出,置室溫下自然風干后備用。將浸泡過大蒜素(處理區域)和蒸餾水(不用藥,空白對照區域)的半圓濾紙片放入圓盤中,周圍涂凡士林。處理區域和空白對照區域各占一半,在上、下、左、右和圓心處放置鐵塊固定濾紙片。每次試驗選取20只雞皮刺螨放置于圓心處,使其在場地內自由活動,并在裝置上方覆蓋遮光布,以使試驗在黑暗中進行;5 min后移去遮光布后觀察雞皮刺螨在濾紙片上的分布情況,以雞皮刺螨在某側濾紙片上停留2 min記為雞皮刺螨對該側做出選擇,對處理區域和空白對照區域停留的雞皮刺螨進行計數。試驗重復3次,每次使用不同批次雞皮刺螨。計算不同濃度大蒜素溶液對雞皮刺螨的平均驅避率,并計算驅避50%雞皮刺螨時的大蒜素使用濃度(Half maximal repellence concentration,RC50)和驅避100%雞皮刺螨時的大蒜素使用濃度(Maximal repellence concentration,RC100)。按公式(1)計算驅避率,并繪制不同濃度大蒜素溶液對雞皮刺螨的驅避率的驅避活性曲線。

驅避率(%)=(空白對照區域蟲數-處理區域蟲數)÷總蟲數×100%

(1)

1.2.2 不同濃度和劑型大蒜素對雞皮刺螨的驅避效果 驅避裝置和方法同1.2.1。該試驗處理組選用0.5%、1.0%和3.0%大蒜素水乳劑和長效驅避劑,對照組選用OFF驅蚊液、1.0%驅蚊酯長效驅避劑,空白對照組為蒸餾水。試驗模擬臨床情況,在25～28 ℃室溫下暴露在空氣中進行,分別于試驗開始后5 min(后稱第0天)、第2、4、6、8、10、12、14天觀察并記錄處理區域和空白對照區域停留的雞皮刺螨數,測定不同濃度和劑型大蒜素對雞皮刺螨的驅避效果和持效時間。

1.2.3 數據處理 繪制1.2.2中不同藥物、不同時間點對雞皮刺螨的驅避率的變化曲線,并用Kruskal-Wallis H檢驗對不同藥物同一時間點對雞皮刺螨驅避活性進行差異性分析。

2 結果

2.1 不同濃度大蒜素對雞皮刺螨的驅避活性 根據不同濃度大蒜素對雞皮刺螨的驅避率繪制驅避活性曲線,如圖1所示,大蒜素濃度為0.5～4.0 mg/mL時,驅避率和大蒜素濃度呈正相關,隨大蒜素濃度的增加而增加;大蒜素濃度為0.5 mg/mL時驅避率最低,為3.3%;大蒜素濃度為4.0 mg/mL時驅避率最高,為100%。另外,大蒜素濃度為0.5～4.0 mg/mL時,驅避率與其濃度的改變具有一定的線性關系,其線性方程為y=14.215x-6.309,R2為0.968,依據線性方程計算的RC50和RC100分別為1.98和3.74 mg/mL。

圖1 大蒜素對雞皮刺螨的驅避活性曲線Fig.1 Repellent activity curve of allicin against Dermanyssus gallinae

2.2 不同濃度和劑型大蒜素對雞皮刺螨的驅避效果

2.2.1 不同濃度和劑型大蒜素的驅避效果 結果如表1和圖2所示,6個處理組在第0天時對雞皮刺螨的驅避率介于83.33%～100%,其中3.0%大蒜素水乳劑和長效驅避劑的驅避率均達100%;在第2天時,0.5%、1.0%和3.0%大蒜素水乳劑對雞皮刺螨的驅避率與第0天相比開始下降,并分別在第4、6、6天之后下降至10%以下,與空白對照組無顯著差異(P>0.05);不同濃度大蒜素長效驅避劑的驅避率也逐天呈下降趨勢,其中0.5%、1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑分別在第8、10、10天之后下降至10%以下,與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。

表1 不同組別14 d內對雞皮刺螨的驅避率Table 1 Repellent rates of Dermanyssus gallinae in different groups during 14 days (%)

圖2 不同濃度和劑型大蒜素處理組在不同時間的驅避率變化Fig.2 Repellent rate changes at different times for allicin treatment groups of different concentrations and formulations

在0～4 d時,0.5%、1.0%和3.0%大蒜素水乳劑對雞皮刺螨驅避率隨濃度增加而增大,且在第0天時,3.0%大蒜素水乳劑驅避率顯著大于0.5%大蒜素水乳劑(P<0.05),2～4 d時,3.0%大蒜素水乳劑驅避率顯著大于0.5%和1.0%大蒜素水乳劑(P<0.05)。在0～8 d時,0.5%、1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑對雞皮刺螨驅避率隨濃度增加而增大,在第0天時,3.0%大蒜素長效驅避劑驅避率顯著大于0.5%大蒜素長效驅避劑(P<0.05),2～8 d時,0.5%大蒜素長效驅避劑驅避率顯著低于1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑(P<0.05),但1.0%大蒜素長效驅避劑和3.0%大蒜素長效驅避劑之間驅避率無顯著差異(P>0.05)。第0天時,相同濃度的大蒜素水乳劑和長效驅避劑驅避率無顯著差異(P>0.05)。0.5%、1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑的驅避率分別在2～4 d、2～6 d、2～8 d內均顯著大于同濃度的大蒜素水乳劑(P<0.05)。

2.2.2 大蒜素長效驅避劑與其他幾種驅避劑的驅避效果比較 由2.2.1結果可以看出,大蒜素長效驅避劑效果優于大蒜素水乳劑,故選用不同濃度大蒜素長效驅避劑和市售驅避劑做進一步分析。OFF驅蚊液和驅蚊酯長效驅避劑中有效成分分別為避蚊胺和驅蚊酯,這2種成分被廣泛應用于驅蟲,對雞皮刺螨也有一定的驅避作用[8]。如表1和圖3所示,在第0天時,不同濃度大蒜素長效驅避劑和OFF驅蚊液對雞皮刺螨驅避率均顯著大于驅蚊酯長效驅避劑(P<0.05)。0.5%、1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑、OFF驅蚊液、驅蚊酯長效驅避劑驅避率分別在第8、10、10、8、8天時下降至10%以下,與空白對照組無顯著差異(P>0.05)。在2～8 d時,1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑驅避率顯著大于OFF驅蚊液和驅蚊酯長效驅避劑(P<0.05),且OFF驅蚊液和驅蚊酯長效驅避劑與0.5%大蒜素長效驅避劑驅避效果相似,在第2天時,驅蚊酯長效驅避劑驅避率顯著低于OFF驅蚊液和0.5%大蒜素長效驅避劑(P<0.05),其余時間點三者之間無統計學差異(P>0.05)。

圖3 不同濃度大蒜素長效驅避劑和市售驅避劑在不同時間的驅避率變化Fig.3 Repellent rate changes at different times for different concentrations of allicin long-acting repellent And commercial repellent

按驅避率與空白對照組有顯著差異作為有效驅避(即驅避率為20%以上),0.5%、1.0%、3.0%大蒜素水乳劑和長效驅避劑、OFF驅蚊液、驅蚊酯長效驅避劑的持效時間分別為2、2、4、4、6、8、4、6 d(表2)。

表2 不同驅避劑持效時間Table 2 Effective duration of different repellents

3 討論

Wang等[9]對我國規模化養雞場進行調查,結果顯示,64.1%的雞場存在雞皮刺螨感染,對養殖業產生較大危害。尤其在飼養情況不規范的情況下雞更易受雞皮刺螨的侵擾,會導致生產率下降,造成巨大經濟損失[10]。此外,雞皮刺螨也可寄生于人體,造成皮膚瘙癢和皮炎,危害養殖場工人及附近居民健康。雞皮刺螨易產生耐藥性,因此殺蟲劑無法將其完全殺滅,比如曾使用的有機磷殺螨劑逐漸失效,且其毒性較大,會對環境造成污染。雞皮刺螨病作為一種影響世界養禽業發展的疾病,應開發出一種基于生態學的、可持續的、不影響人類健康的控制措施。

3.1 大蒜素對雞皮刺螨具有驅避效果 本試驗結果顯示,大蒜素濃度越高,對雞皮刺螨的驅避率越高、持效時間越長。植物源驅避劑多為植物的根、莖、葉、花的提取物,有效成分多為酯類、萜類、醇類和酮類等化合物[11]。大蒜具有天然的抗蟲特性,大蒜和其他作用作物共同栽培能有效減少田間害蟲的數量。同時,大蒜素提取物也能作為生物農藥,對蚜蟲、玉米象和赤擬谷盜等均有效果[12,13]。大蒜素的化學名為二烯丙基硫代亞磺酸酯,是大蒜中最主要的活性成分,是一種具有刺激性氣味的硫化物[14],這種獨特的氣味使大蒜素具有防蟲和驅蟲作用。大蒜素的特殊氣味可能會刺激雞皮刺螨中的嗅覺感受器——跗感器[15],使其遠離大蒜素。

雞在發育過程中可能會由油脂腺產生利它素[16],雞皮刺螨可以利用利它素來定位潛在的宿主,便于其侵襲宿主。而驅避劑能夠依靠物理或化學作用阻止昆蟲接觸其宿主,這種忌避作用能夠安全有效的防控雞皮刺螨,并且能降低該寄生蟲產生耐藥性的概率[17]。驅避劑可能會包含刺鼻性氣味,但氣味污染是暫時的,不會對生態環境造成長久的危害。常用的氣味驅避劑主要為間接驅避劑[18],其能夠形成氣味屏障,阻止寄生蟲定位或影響寄生蟲采食行為。

除大蒜素外,許多植物精油也被證實對雞皮刺螨有驅避作用。Camarda等[19]對雞舍使用20%印楝精油,1周霧化3次,雞皮刺螨感染率下降了94.65%～99.80%。一些唇形科植物精油也具有驅避效果,比如牛至、香薄荷和百里香等都含有香芹酚,在1%濃度以上能夠對雞皮刺螨產生驅避作用[20]。利用百里香精油和薰衣草精油進行體外試驗,都能夠對雞皮刺螨產生較好的驅避活性,分別為80%[21]和40%[22]。對雞皮刺螨有驅避效果的還有香葉(含22.03%氧化丁香烯)、艾葉(含31.50% α-側柏酮、11.92% β-側柏酮、12.30%樟腦和10.09% 1,8-桉葉素),但各成分驅避效果未知[23,24]。1.3 μg/m2的肉桂精油和丁香精油在24 h顯示出對雞皮刺螨100%驅避率[25]。對肉桂和丁香進行氣相色譜試驗,肉桂中的桂皮醛、香豆素、2-甲氧基肉桂醛和丁香中的β-丁香烯、丁香酚、乙酸丁香油酚酯均有驅避效果[25]。大蒜素對雞皮刺螨起驅避作用的具體成分還未知,未來通過對大蒜素有效成分的測定能夠研發出更高效的控制雞皮刺螨的制劑。

3.2 大蒜素長效驅避劑驅避效果較好 本試驗還比較了大蒜素長效驅避劑和大蒜素水乳劑的驅避效果,相同濃度的大蒜素長效驅避劑和水乳劑在第0天時的驅避率沒有顯著差異,但在第2天及以后,大蒜素水乳劑的驅避率下降速度大于大蒜素長效驅避劑。大蒜素長效驅避劑的持效時間更長,驅避率更高,且優于市售驅避劑。這可能是由于長效驅避劑中添加了聚乙烯吡咯烷酮,溶劑揮發后其交聯成網,進而使大蒜素釋放延緩[26]。長效驅避劑具有一定黏性,可以很好地附著在雞體表和環境表面,考慮到持效期,可能需要多次重復使用才能起到較好的保護作用。在植物提取物驅避劑的研制中,除了驅避成分的選擇,還需要注意減少其揮發,提高其持效時間。選擇緩釋劑型可以減少藥物滲入皮膚、減少蒸發、提高穩定性,常用的劑型有微囊、凝膠、納米乳、脂質體和環糊精包結化合物[27]。有研究比較了DEET微膠囊制劑與未包微膠囊制劑,在DEET濃度為0.45和0.75 mg/cm2時,微膠囊制劑皮膚滲透吸收率分別減少了35%和23%[28]。史衛國等[29]在DEET中加入高分子避蚊胺和氯菊酯,成品有效驅蚊時間長達8 h,而市售驅避劑的持效時間僅能持續1～4 h。王樹根等[30]使用一氯均三嗪-β-環糊精包合DEET,使DEET進入環糊精的空腔內,使包合物耐熱、耐堿,穩定性良好。

綜上所述,在本試驗中大蒜素對雞皮刺螨的RC50和RC100分別為1.98和3.74 mg/mL。對不同濃度和不同劑型的大蒜素的驅避活性進行的研究中發現,大蒜素濃度越高,驅避活性越好;相同濃度下大蒜素長效驅避劑較大蒜素水乳劑驅避活性更好。1.0%和3.0%大蒜素長效驅避劑的持效時間可達8 d,優于市售驅避劑。結果表明,大蒜素長效驅避劑可作為臨床防治雞皮刺螨的新藥物。