茶樹菇多糖對小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫功能的影響

劉 莉 , 陸 輝 , 蔡高峰 , 武彩紅 , 李 玲 , 陳曉蘭 , 張雪麗

(1. 江蘇農牧科技職業學院 , 江蘇 泰州 225300 ; 2. 南京農業大學動物醫學院 , 江蘇 南京 210095)

茶樹菇是一種食藥兼用真菌,隸屬真菌門,學名為柱狀田頭菇,因其生長在油茶樹的枯干上而得名為茶樹菇[1]。茶樹菇不僅是營養豐富的滋補佳品,而且具有扶正強體作用,享有“中華神菇”“菌中之冠”之美稱[2]。自20世紀90年代茶樹菇被列為珍稀菇品開發以來[3],目前成本低、產量高的茶樹菇栽培方法業已成熟,為茶樹菇的應用和開發奠定了基礎。

多糖是菌菇中含量最豐富的活性成分之一,在菌絲體、子實體和發酵液中均可獲得[4]。菌菇多糖因具有降血糖、降血脂、抗腫瘤和免疫調節等生物活性,在現代醫學中備受關注[5]。在國際上,具有食藥用價值的菌菇多糖更是被稱為“生物應答效應物”[6]。

茶樹菇多糖(Agrocybaegeritapolysaccharid,AAP)的主要成分為蛋白多糖,由葡萄糖、果糖、半乳糖和甘露糖等組成[7,8]。研究表明,AAP具有較強的抗氧化能力,可清除活性氧自由基[9-11]。陳少英等[4]研究也表明,3種不同方法提取的AAP經灌喂給藥,小鼠血清超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性增加和肝臟中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量降低均與對照組存在顯著差異,證明AAP具有抗氧化活性。徐靜娟等[12]對荷瘤小鼠進行研究,發現AAP對荷瘤小鼠S180移植肉瘤和S180腹水瘤具有抑制作用,且可提高人工免疫抑制小鼠的白細胞數。也有學者對AAP的免疫功能進行了研究,發現其可以促進小鼠的特異性免疫應答和非特異性免疫應答[13],增加正常小鼠的脾臟重量,提高小鼠巨噬細胞的吞噬能力[8]。

目前,相對于其他菌菇多糖,AAP的研究較為缺乏,AAP免疫調節作用的機制還不清楚。鑒于此,本試驗以常用的小鼠巨噬細胞為研究對象,探討AAP對其表面分子抗原分化簇80(Cluster of differentiation 80,CD80)和86(Cluster of differentiation 86,CD86)及白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和一氧化氮(Nitrogen oxide,NO)表達的影響,為進一步闡明AAP的免疫功能和作用機制提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和材料 SPF級6周齡ICR小鼠,購自揚州大學實驗動物中心[SCXK(蘇)2022—0009],自由采食和飲水。遵照江蘇農牧科技職業學院動物倫理委員會相關規定和要求進行飼養管理。

1.2 主要試驗藥物和材料 RAW264.7(小鼠巨噬細胞),購自美國細胞培養物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC細胞庫)。RPMI1640培養基、FBS胎牛血清、胰酶和雙抗,均購自Gibico公司;DMEM高糖培養基,購自上海源培生物科技有限公司;Mouse-IL-1β、Mouse-IL-6和Mouse-TNF-α ELISA檢測試劑盒,均購自杭州聯科生物科技有限公司;異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的CD80(FITC-CD80)和藻紅蛋白(Pphycoerythrin,PE)標記的CD86(PE-CD86),均購自eBioscience公司;NO檢測試劑盒,購自南京建成生物工程有限公司。

1.3 主要儀器和設備 精密電子天平(FA1104N),上海精密科學儀器有限公司;磁力攪拌器(85-1),上海志威電器有限公司;流式細胞儀(BD-C6),BD FACSVverse公司;BioTek Epoch全波長酶標儀,BioTek Instruments公司;CO2培養箱(SC010W-2),Revco公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 AAP提取 AAP與石油醚按1∶3(體積比)于60 ℃水浴加熱進行脫脂;過濾后濾渣與乙醇按1∶3(體積比)于80 ℃水浴,以除去小分子的醇溶物;過濾后再將濾渣與水按1∶10(體積比)提取2次,過濾后合并濾液并濃縮。在濾液中加入一定量無水乙醇至最終醇濃度為80%,進行醇沉,收集沉淀,分別用無水乙醇、丙酮和乙醚洗滌,真空干燥,得粗多糖(AAP)。使用時用RPMI1640完全培養液溶解。

1.4.2 RAW264.7細胞培養 RAW264.7細胞采用DMEM培養基(含10%胎牛血清和2%雙抗)于培養箱中(37 ℃、5%CO2)培養,當細胞融合度達到90%時,用0.25%胰酶EDTA溶液消化細胞,取細胞進行后續試驗。

1.4.3 AAP對RAW264.7細胞的安全濃度 取對數生長期的RAW264.7細胞(生長至90%融合度)用0.25%胰酶消化,完全培養液調節細胞密度至1.0×106個/mL;將細胞懸液加到96孔細胞板中,100 μL/孔,每孔加入100 μL含不同濃度AAP的無菌完全培養液,終濃度依次為2 000、1 000、500、250、125、62.50、31.25、15.63 和7.81 μg/mL,每個濃度6個重復孔,以完全培養液作為空白對照組。在37.5 ℃、5% CO2條件下培養24 h后加入15 μL 四甲基偶氮唑藍(Methylthiazolyl tetrazolium,MTT),4 h后棄去上清,加入100 μL二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),微量振蕩器振蕩5 min,于570 nm波長處檢測各孔的吸光度(Optical density,OD)值,按公式(1)計算RAW264.7細胞活力。以巨噬細胞活力小于空白對照組的濃度為AAP的最大安全濃度。

細胞活力(%)=AAP組OD570 nm÷空白對照組OD570 nm×100%

(1)

1.4.4 分組與處理 試驗共設5個組,分別為空白對照(CON,DMEM完全培養液)組、AAP低劑量(AAP-Low,AAPL,50 μg/mL)組、AAP中劑量(AAP-Mid,AAPM,100 μg/mL)組、AAP高劑量(AAP-High,AAPH,200 μg/mL)組和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS,50 ng/mL)組,每組重復4個孔,將細胞板置于5% CO2、37.5 ℃條件下培養24 h。

1.4.5 AAP對RAW264.7細胞表面分子表達的影響 將各組細胞吹打均勻后轉入離心管離心(4 000 r/min,5 min),收集細胞,PBS洗滌細胞1次,然后加入FITC-CD80和PE-CD86抗體各1 μL,避光條件下吹打混勻后置于4 ℃孵育30 min;再用PBS離心(4 000 r/min,5 min)洗滌細胞2次,避光條件下進行流式檢測。

1.4.6 AAP對RAW264.7細胞因子表達的影響 收集細胞上清液,按ELISA檢測試劑盒說明書操作檢測細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NO含量。

2 結果

2.1 AAP對RAW264.7細胞的安全濃度 結果如圖1所示,AAP濃度在15.63～125 μg/mL范圍時,細胞活力均高于空白對照組,結果表明,AAP濃度高于250 μg/mL時才會對RAW264.7細胞產生一定的毒性,因此,選擇濃度低于250 μg/mL AAP進行后續試驗。

圖1 AAP對RAW264.7細胞活力的影響Fig.1 Effects of AAP on RAW264.7 cell viability

2.2 AAP對RAW264.7細胞表面分子CD80和CD86表達的影響 不同濃度AAP與RAW264.7細胞作用24 h后,用細胞表面分子相應的熒光抗體進行標記,流式細胞術檢測CD80+和CD86+細胞百分比,結果如圖2所示,與CON組相比,除AAPL組外(P>0.05),AAPM組、APPH組和LPS組RAW264.7細胞的表面分子CD80的表達均顯著升高(P<0.01或P<0.001),所有AAP組和LPS組RAW264.7細胞的表面分子CD86的表達均顯著升高(P<0.01或P<0.001)。AAP中、高劑量均可顯著提高CD80+和CD86+細胞比例,且APPH組表達優于AAPM組。結果表明,適當濃度AAP可以顯著活化RAW264.7細胞,且呈劑量依賴性。

圖2 AAP對RAW264.7表面分子CD80和CD86表達的影響Fig.2 Effects of AAP on expressions of cell surface molecule CD80 and CD86 in RAW264.7 cellsA:RAW264.7表面分子CD80流式細胞圖; B:RAW264.7表面分子CD86流式細胞圖; C:CD80+細胞所占比例; D:CD86+細胞所占比例與空白對照組相比,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;下同A:Flow cytometry of RAW264.7 surface molecule CD80; B:Flow cytometry of RAW264.7 surface molecule CD86; C:Ratio of CD80+ cells; D:Ratio of CD86+ cells Compared with the CON group,*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001. The same as below

2.3 AAP對RAW264.7細胞因子表達的影響 不同濃度AAP與RAW264.7細胞作用24 h后,收集細胞上清,檢測細胞因子的表達水平,結果如圖3所示,與CON組相比,AAPH組IL-1β表達水平顯著增加(P<0.01),AAPM組和AAPH組IL-6表達水平增加具有統計學意義(P<0.05);AAPL組、AAPM組和AAPH組分泌的TNF-α均極顯著增加(P<0.001);AAPM組和AAPH組釋放的NO增加也具有統計學意義(P<0.05),且后者差異顯著(P<0.01);LPS組也可顯著提高RAW264.7細胞分泌的IL-1β、IL-6和TNT-α以及釋放的NO(P<0.01或P<0.001)。結果表明,AAP可以顯著提高RAW264.7細胞因子的表達和NO的釋放能力,且呈劑量依賴性。

圖3 AAP對RAW264.7細胞IL-1β(A)、IL-6(B)、TNF-α(C)和NO(D)濃度的影響Fig.3 Effects of AAP on concentrations of IL-1β(A),IL-6(B),TNF-α(C)and NO(D) in RAW264.7cells

3 討論

巨噬細胞是機體重要的免疫細胞,具有抗原呈遞、調節T細胞和B細胞免疫等作用[14],常常作為評價活性成分的免疫調節能力的重要載體[15]。研究表明,巨噬細胞受到LPS刺激后,其表面的共刺激分子CD80和CD86會高表達[16]。同時,LPS刺激巨噬細胞,可促進IL-1β、IL-6、TNF-α和NO等細胞因子表達,進而激發免疫應答[17]。細胞因子對CD80和CD86的表達也具有調節作用[16]。因此,利用LPS刺激巨噬細胞是進行藥物機制研究的良好模型[18]。本試驗以小鼠巨噬細胞RAW264.7為模型,以LPS為陽性對照,研究AAP對RAW264.7細胞CD80和CD86的表達及細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NO等表達的調節作用。

CD80和CD86是巨噬細胞活化的標志分子,屬于免疫球蛋白超家族成員[19],CD86作為CD80的配體,二者共同調節T細胞活化,調節免疫應答[20]。在抗原遞呈細胞(Antigen-presenting cells,APC)中,協同刺激分子CD80和CD86最具有特征,二者無論發生質變還是量變,均會影響巨噬細胞抗原提呈能力,影響免疫功能[16]。本試驗結果顯示,與CON組比較,AAP組均可提高CD80+和CD86+細胞的比例,且AAPH組的CD80+細胞百分比以及AAPM組和AAPH組的CD86+細胞百分比均高于LPS組,說明AAP對巨噬細胞具有免疫調節作用,并呈一定的劑量依賴性。

研究表明,植物多糖不僅可刺激巨噬細胞表面分子的表達,而且可誘導巨噬細胞分泌細胞因子,從而通過免疫調節作用提高機體的免疫力[21]。IL-1β、IL-6和TNF-α是由巨噬細胞產生的最具代表性的細胞因子,可參與機體免疫應答[22,23]。NO是重要的信使分子,其合成和釋放的增加是說明巨噬細胞被激活并參與免疫反應的一個重要指標[24]。NO也可刺激TNF-α、IL-6和IL-1β等細胞因子的分泌[25]。本試驗結果也顯示,AAP不僅可刺激RAW264.7細胞表面分子CD80和CD86的表達,而且可誘導RAW264.7分泌IL-1β、IL-6、TNF-α和NO,并表現出劑量依賴性。Yang等[26]研究也表明,生姜多糖可誘導巨噬細胞分泌NO、TNF-α、IL-1β和IL-6等發揮免疫作用的細胞因子。劉蘇等[27]對5種食用菌多糖的免疫活性進行比較研究,發現平菇多糖、茶樹菇多糖、香菇多糖、木耳多糖和金針菇多糖5種食用菌多糖均可刺激小鼠腹腔巨噬細胞產生NO,分泌TNF-α和IL-1β。這些研究成果均與本試驗結果一致。Lee等[28]研究表明,多糖可有效激活巨噬細胞,使其分化為 M1巨噬細胞。NO和促炎因子分泌增加以及參與啟動免疫,則是M1巨噬細胞的典型特征。

綜上所述,推測AAP通過激活小鼠巨噬細胞RAW264.7,刺激其分化為M1巨噬細胞,上調共刺激分子CD80和CD86表達,進一步促進IL-1β、IL-6、TNF-α和NO的表達,參與免疫調節。AAP能提高小鼠體外巨噬細胞RAW264.7的免疫調節活性,并且當AAP濃度為200 μg/mL時,不僅能顯著上調巨噬細胞表面分子CD80和CD86的表達,而且能顯著促進細胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌和NO的釋放。表明AAP具有提高小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫能力的作用。該結果對于AAP的臨床應用和開發具有一定的參考價值。