L-10BPA中間體合成工藝優(yōu)化及連續(xù)流可行性工藝研究

＊關東 董珍 陳凱 李國威 廖競遠 黃均榮 游恒志*

（1.深圳市中核海得威生物科技有限公司 廣東 518057 2.哈爾濱工業(yè)大學（深圳） 廣東 518055）

引言

硼中子捕獲療法（Boron Neutron Capture Therapy，BNCT）是一種新興的二元靶向治療方式，旨在改善傳統(tǒng)上難以治療腫瘤的治療率。其原理是將對腫瘤有特異性親和力的10B化合物注入人體，經(jīng)中子束局部照射使聚集在腫瘤組織中的10B與熱中子發(fā)生核反應，利用生成的7Li與α粒子破壞腫瘤組織[1-2]。α粒子的范圍很短，優(yōu)先影響腫瘤組織，同時避免更遠端的正常組織受到損傷。目前，L-10BPA是已知可利用BNCT治療癌癥的重要硼化物[3]。富含10B的L-BPA的合成方法已有許多文獻報道，但現(xiàn)有技術都存在成本較高，合成條件苛刻等缺陷[4]，因此需要成本低、合成條件溫和的合成方法。本研究擬參考前人路線，在其基礎上設計正交實驗優(yōu)化釜式反應條件，對釜式反應的條件進行優(yōu)化，并根據(jù)釜式參數(shù)探討了連續(xù)流合成技術的可行性，連續(xù)流工藝對于金屬有機試劑在反應過程中放出的大量熱能以微熱的形式排出體系之外，可降低危險性以及反應的放大效應[5]。

1.實驗材料

（1）主要儀器。Agilent 1260高效液相色譜：美國Agilent公司；ME204E電子天平（萬分之一）：梅特勒-托利多公司；IKA RV3 eco旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA公司；震蕩式連續(xù)流微通道反應器：深圳一正科技有限公司。（2）主要試劑。N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸、異丙基氯化鎂（2M in THF）、硼酸三正丁酯；硼-10酸，深圳中核海得威生物科技有限公司；其他試劑和溶劑均為市售分析純。

2.實驗方法

（1）釜式反應制備L-BPA中間體。合成路線如圖1所示。首先，精確稱量1.00g（16.17mmol，1eq.）硼酸加入反應瓶中，加入磁子，稱量5.40g（72.77mmol，4.5eq.）正丁醇加入反應燒瓶中，攪拌均勻。室溫條件下將31.72mg（0.32mmol，0.02eq.）濃硫酸加入反應體系中。搭建回流裝置，常壓條件下油浴升溫至130℃，攪拌反應4h，將反應過程生成的水分分出，餾出的水體積不再增加且水的總體積與理論計算體積相近，常壓條件下油浴升溫至170℃，將反應體系中未反應完全的正丁醇蒸餾出來，至餾出體積不再變化且正丁醇餾出總體積和理論計算體積相近。將反應體系降溫至50℃，油泵開啟穩(wěn)定后接入蒸餾裝置中，抽真空條件下將反應體系升溫至110℃，分出硼-10酸三正丁酯，至最終無餾分蒸出且反應瓶中無液體，收集得到3.1850g無色透明液體立即密封。精確稱量1.00g（2.55mmol，1eq.）的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸，將其加入到schlenk管中，加入磁子，密封schlenk管，抽真空，置換氮氣循環(huán)3次。室溫下加12.5mL的無水THF，攪拌溶解后置于-30℃下預冷10min，使反應體系溫度降低至-30℃。在30min內(nèi)緩慢滴加完10mL（20.4mmol，8eq.）異丙基氯化鎂（2.0M in THF），繼續(xù)在-30℃條件下反應4h。再往體系中緩慢滴加0.85mL（3.19mmol，1.25eq.）的硼酸酯，繼續(xù)在-30℃下反應過夜，TLC監(jiān)測反應完成情況。待底物N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸完全反應后加入38.25mL純水淬滅反應，攪拌10min，溶液凝固，取出schlenk管置于室溫，攪拌。固體消失后，緩慢滴加38.25mL（1mol/L）稀鹽酸，攪拌2h，溶液逐漸變澄清透明。使用乙酸乙酯萃取，有機相用無水硫酸鈉干燥，真空下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，抽真空，完全除去溶劑，得到粗產(chǎn)品0.86g。最后，快速反相柱層析分離，得到0.496g白色粉末純產(chǎn)物，產(chǎn)率63%。

（2）連續(xù)流式反應制備L-BPA中間體。連續(xù)流式反應合成路線如圖2所示。首先，取下注射器，并在流路A，B，C三處同時以氮氣吹掃10min，排除體系中水氧。精確稱量0.6mmol的N-叔丁氧羰基-4-碘-L-苯丙氨酸234.72mg，以THF為溶劑配制4.8mL溶液，接入流路A；量取異丙基氯化鎂溶液（1Min THF）4.8mL，接入流路B；精確稱量0.75mmol硼酸酯172.62mg，以THF為溶劑配制9.6mL溶液，接入流路C；同時以25μL/min的流速注入流路A，B，使兩者在反應器1中進行反應；以50μL/min的流速注入流路C，在反應器2中與第一步反應產(chǎn)物進行硼酯化，流出液后處理與釜式反應一致。

圖2 連續(xù)流式反應過程示意圖

3.實驗結果與討論

（1）釜式反應實驗條件優(yōu)化。通過前期調(diào)研，本研究選取了格氏試劑、硼酸酯、溶劑、溫度進行了實驗設計，對每個因素分別設置了3個水平，以分析這四個因素不同水平分布對結果的影響，如表1所示。

表1 L9（34）正交實驗表及結果

從以上分析可得，影響產(chǎn)物合成的因素貢獻順序為A＞B＞C＞D，即格氏試劑的用量＞硼酸酯的用量＞溫度＞溶劑的量。格氏試劑和硼酸酯當量的變化對于反應的產(chǎn)率影響較大，格氏試劑的當量對結果影響最為顯著。綜上，最優(yōu)的釜式反應條件為：格氏試劑8當量，硼酸正丁酯1.25當量，溫度為-30℃，溶劑THF為0.2mol/L。最佳反應條件在9組實驗中并沒有出現(xiàn)。在此條件下，重復3次驗證實驗，得到的實驗產(chǎn)率分別是75%、78%及76%，證明了正交實驗的準確性。

（2）釜式反應后處理條件優(yōu)化。本文還探究了后處理時酸化的反應條件，結果如表2所示。

表2 后處理優(yōu)化研究

實驗結果表明，當使用不同濃度的鹽酸時，0.5mol/L的HCl在酸化2h后得到63%的產(chǎn)率，隨著稀鹽酸濃度的逐漸提升（1～2mol/L），分離產(chǎn)率開始下降。這可能是由于在此鹽酸濃度（1～2mol/L）下2h的攪拌時間過長，導致Boc基團脫落，目標產(chǎn)物減少。而使用濃鹽酸攪拌1h，實驗分離產(chǎn)率為52%，可能是濃鹽酸酸化1h太劇烈導致生成了副產(chǎn)物，目標產(chǎn)物產(chǎn)率不高。

（3）連續(xù)流工藝的結果。根據(jù)上述釜式反應得到的較優(yōu)實驗條件，同時根據(jù)連續(xù)流工藝的特點及圖2所示的實驗裝置和條件進行連續(xù)流式反應，分別合成了天然B和10B同位素的L-BPA中間體(S)-Boc-4-二羥基硼基-苯丙氨酸。在連續(xù)流式反應下，克級反應實驗的分離產(chǎn)率為57%，反應時間2h。所獲得產(chǎn)物通過核磁共振圖譜進行了定性表征。用氘代DMSO作溶劑，采用1H NMR和13C NMR表征了目標產(chǎn)物，核磁圖及高分辨質(zhì)譜圖結果示于圖3。高分辨質(zhì)譜顯示，天然B（測試值為：C14H2011BNNaO6+=332.1289；計算值為：C14H2011BNNaO6+=332.1276）和10B同位素（測試值為：C14H2010BNNaO6+=331.1318；計算值為：C14H2010BNNaO6+=331.1212）的實驗結果與計算結果吻合，證明合成產(chǎn)物確為目標分子。

4.結論

L-10BPA在BNCT治療腫瘤方面有著極其重要的應用價值，是目前市場上唯一一種使用BNCT技術治療腫瘤的同位素硼藥。本研究通過設計正交實驗優(yōu)化了釜式反應的條件，并且對反應后處理和提純方式進行了優(yōu)化。該方法制成的L-10BPA中間體克級反應分離收率63%，而且通過連續(xù)流技術可以實現(xiàn)L-10BPA中間體(S)-Boc-4-二羥基10硼基-苯丙氨酸的連續(xù)和快速合成，連續(xù)流式反應實驗的分離收率57%。本研究為進一步工業(yè)化放大生產(chǎn)L-10BPA提供了基礎。