養豬廢水厭氧儲存過程中的氮素轉化特征

＊高啟燕 趙心悅 周啟發*

（1.臺州海關綜合技術服務中心 浙江 318001 2.浙江大學生命科學學院 浙江 310058）

引言

在過去的幾十年里，養豬場已經從小型家庭農場轉變為大型集中動物飼養場，以較低的成本提高生豬產量。根據世界觀察研究所進行的研究，大型集中動物飼養場產量占全球豬肉產量的55%[1]，豬廢水含有高濃度的氨、顆粒有機物（POM）和溶解性有機物（DOM）以及多種微生物[2-5]。養殖廢水可以作為液體肥料[6]和灌溉水[7]再利用，因為它含有大量有價值的水和養分，可以促進植物更好地生長。

一般來說，污水在使用前應儲存一段時間，這在一些國家有規定，例如意大利、芬蘭、丹麥和中國。在含氨廢水或沼渣的儲存過程中，復雜的氮（N）轉化，包括硝化-反硝化、氨氧化、厭氧氨氧化和部分硝化-厭氧氨氧化、氨同化和固氮[8-11]，可能會顯著影響廢水或消化液在施用后的水質和肥料質量。具體而言，一些氮轉化（例如氨的揮發、硝化反硝化和氨氧化）會導致廢水儲存過程中大量的氮損失，這會污染環境并減少提供給植物的養分量[11]。然而，在污水或沼渣的長期儲存過程中，僅研究了有限的氮轉化[11]。因此，深入研究養殖廢水儲存期間包括氨同化的氮損失和氨轉化，可為養豬廢水作為液體肥料和灌溉水進行再利用提供重要的科學依據。本研究通過測定不同儲存時間的pH、TOC、總氮（TN）、氨氮（NH4-N）、硝態氮（NO3-N）、亞硝態氮（NO2-N）、尿素含量，定量表征氮損失情況，并通過宏基因組測序結果分析氮轉化機理。

1.材料與方法

(1)材料

養豬廢水采自浙江省湖州市的一養豬場。廢水使用前通過濾紙（中國雙泉公司）過濾。該廢水具有養豬廢水的典型特征（如高氨氮、高TOC等）。

(2)厭氧儲存試驗

2020年11月至2021年4月，在封閉式2.0mm厚的聚丙烯塑料容器（工作容積25L）中進行厭氧儲存試驗，溫度保持在25～30℃。

表1 本研究用養豬廢水性質（n=3）

(3)廢水性質測定

儲存過程中每30天采集一次水樣。每個廢水樣品通過0.45μm纖維素膜過濾，并收集上清液進行分析。氫離子濃度（pH）使用PHB-4 pH計（中國上海INESA公司）測量。總有機碳TOC使用總有機碳分析儀（德國JENA公司，MULTI N/C 3100）進行測量。用微量凱氏定氮法測定總氮TN，并按照Nash試劑分光光度法測定NH4-N含量（SEPA，2002[12]）。使用離子色譜法（Dionex ICS-1500離子色譜系統，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）測定NO3-N和NO2-N[10]。可溶性有機氮SON的計算方法是總氮TN減去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用雙乙酰單肟試劑比色法測定。

(4)宏基因組分析

在儲存第0天、60天、120天和180天從每個容器中收集50mL廢水，水樣通過0.45μm混合纖維素酯過濾器進行過濾，用TIANNAMP DNA試劑盒提取總DNA。根據Zhang和Lv[18]的方法進行宏基因組測序和序列處理。使用NEB Next Ultra DNA library Prep Kit for Illumina（美國馬薩諸塞州新英格蘭生物實驗室）構建DNA片段庫后，在Illuminia HiSeq X-Ten平臺上測定序列。使用Trimmatic軟件（v0.36）對原始讀數進行質量控制。使用MEGAHIT軟件（v1.0.6）組裝Clean Reads，并使用MetaGeneMark軟件（v3.38）預測開放閱讀框（ORF）。使用BBMAP軟件將每個樣本的清洗數據映射到初始基因目錄（Unigenes）（http://jgi.doe.gov/data-andtools/bbtools/），并計算映射基因的數量。使用Cotillard等人的公式計算基因豐度。對于單基因的分類學注釋，在DIAMOND軟件（https://github.com/bbuchfink/diamond/）中對公共非冗余（NR）蛋白質序列數據庫進行BLAST搜索。預測基因的蛋白質序列根據《京都基因和基因組數據庫》（KEGG）（2018.01版本）繪制。廢水性質測定儲存過程中每30天采集一次水樣。每個廢水樣品通過0.45μm纖維素膜過濾，并收集上清液進行分析。氫離子濃度（pH）使用PHB-4 pH計（中國上海INESA公司）測量。總有機碳TOC使用總有機碳分析儀（德國JENA公司，MULTI N/C 3100）進行測量。用微量凱氏定氮法測定總氮TN，并按照Nash試劑分光光度法測定NH4-N含量（SEPA，2002）。按照SEPA（2002）描述的方法，使用離子色譜法（Dionex ICS-1500離子色譜系統，加拿大SpectraLab Scientific Inc.）測定NO3-N和NO2-N。可溶性有機氮SON的計算方法是總氮TN減去NH4-N、NO3-N和NO2-N。尿素含量采用雙乙酰單肟試劑比色法測定。

2.結果

(1)廢水性質變化

廢水pH值隨著儲存時間的延長而降低（0～60天），然后持續升高（圖1）。養豬廢水的總有機碳TOC在儲存期間保持降低（圖2）。廢水中總氮TN和氨氮NH4-N含量（圖3）顯著降低，NO3-N和NO2-N含量（圖3）保持非常低，且隨儲存時間延長幾乎不變。而廢水可溶性有機氮SON（圖3）含量顯著增加。厭氧儲存180天后，原始養豬廢水中總氮含量由1319.3mg/L下降到842.9mg/L，損失了36.1%。原始養豬廢水中727.6mg/L的NH4-N發生了轉化，而儲存的養豬廢水中SON增加了202.6mg/L。在四個儲存時間內，溶解性有機氮呈顯著負相關（R2=0.992，n=12，P＜0.001）。結果表明，養豬廢水厭氧儲存期間發生了從NH4-N到SON的顯著的氮損失和氮轉化。

圖1 廢水儲存期間不同時段pH值，數據是三次重復的平均值。條形表示標準誤差

圖2 廢水儲存期間不同時段TOC，數據是三次重復的平均值。條形表示標準誤差

圖3 廢水儲存期間不同時段總氮、氨氮、硝態氮、亞硝態氮和可溶性有機氮含量。數據是三次重復的平均值，條形表示標準差。不同字母表示P＜0.05時的顯著性

(2)氮轉化和氮損失相關的功能基因

①基因譜分析

在養豬廢水厭氧儲存的第0天、60天、120天、180天，分別檢測到245840個、672634個、433604個和248439個基因。PCA分析（圖4）結果表明，基因譜在不同儲存時間的養豬廢水之間明顯分離。支鏈氨基酸轉運蛋白（0.20%～0.45%）、轉座酶（0.13%～0.44%）和ABC轉運蛋白（0.10%～0.17%）基因在整個儲存時間內一直是最豐富的基因。

圖4 不同貯藏時間豬廢水中基因譜的主成分分析（PCA）。SWW0、SWW60、SWW120和SWW180分別代表儲存第0天、60天、120天和180天的養殖廢水

②不同氮轉化模塊的相對基因豐度

如圖5所示，在不同的儲存時間內，反硝化作用DNI和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶Gln的基因豐度始終最高，異化硝酸鹽還原DNR、天冬酰胺合成Aspn和厭氧氨氧化Annamox的基因豐度中等，硝酸鹽同化NA、同化硝酸鹽還原ANR和硝化作用NI的基因豐度非常低。特別的，在整個儲存時間內，反硝化作用的基因豐度始終顯著高于硝化作用。反硝化作用、谷氨酸/谷氨酰胺合成酶、異化硝酸鹽還原和天冬酰胺合成的基因豐度隨儲存時間的延長而趨于降低。結果表明：養豬廢水的反硝化和氨同化（如氨基酸和酰胺的合成）基因活性較高，而硝酸鹽同化、硝化和同化硝酸鹽還原基因活性較低；此外，厭氧氨氧化和異化硝酸鹽還原在養豬廢水中也具有活性。

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3.討論

養豬廢水厭氧儲存180天后，廢水中總氮和氨氮含量顯著降低，而廢水可溶性有機氮顯著增加，試驗結果表明，養豬廢水儲存期間發生了從氨氮到可溶性有機氮的顯著的氮損失和氮轉化，這可能歸因于一些氮反應過程（例如硝化和反硝化作用，氨氧化，厭氧氨氧化和氨揮發）。氨為大多數細菌提供營養，并為尿素合成提供底物，因此可以被細菌轉化為可溶性有機氮。此外，TOC含量明顯下降，表明養豬廢水儲存期間養分損失嚴重。廢水儲存過程中的碳氮損失會污染環境，降低肥料質量。

氮轉化基因譜顯示，廢水儲存中的氮轉化非常復雜，這與之前的研究一致[11,13-16]。值得注意的是，轉座酶、ABC轉運蛋白和氨基轉運蛋白基因被檢測為整個儲存時間內最豐富的基因，這表明這些細菌最終增強了它們的序列插入和運輸功能，以抵抗復雜的環境變化[17]，并在養豬廢水中獲得碳和氮源。同樣，糖和氨基酸的ABC轉運蛋白也被確定為土壤中最豐富的蛋白質[18]。富含氨的養豬廢水在厭氧條件下，硝化作用、硝酸鹽同化和硝酸鹽同化還原的基因豐度一直較低；因此，硝化作用、硝酸鹽同化和硝酸鹽同化還原反應可能很弱。相比之下，反硝化和厭氧氨氧化模塊中的高基因豐度表明養豬廢水的反硝化和厭氧氨氧化活性較高。結果可能與Svehla等人[11]的結果一致，即硝化作用有助于減少液相厭氧的長期儲存期間的氮損失。在整個養豬廢水的儲存過程中，反硝化作用的高基因豐度和厭氧氨氧化作用的中等基因豐度可以解釋養豬廢水厭氧儲存過程中氮的顯著損失。反硝化和厭氧氨氧化模塊中的高基因豐度表明養豬廢水的反硝化和厭氧氨氧化活性較高。此外，盡管硝化作用的底物比反硝化作用豐富得多，但反硝化的基因豐度是硝化作用的2.6～94.1倍，這主要歸因于養豬廢水的厭氧儲存條件。在養豬廢水的儲存過程中，反硝化作用的高基因豐度和厭氧氨氧化作用的中等基因豐度可以解釋養豬廢水厭氧儲存過程中氮的顯著損失。特別的，谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因豐度，包括600個谷氨酸和548個谷氨酰胺合酶基因，在整個儲存時間內始終處于中等水平；而天冬酰胺合成酶的基因豐度，包括353個天冬酰胺合酶基因，在整個儲存時間內始終處于中等水平，表明在養豬廢水厭氧儲存過程中發生了氨向氨基酸和酰胺的活躍的同化作用。由于大多數細菌物種可以吸收養豬廢水中的氨，因此谷氨酸/谷氨酰胺合成酶和天冬酰胺合成酶的基因豐度相當高或適中。此外，氨基酸轉運蛋白基因的高豐度和檢測到的不同氨基轉移酶基因，指示著氨基酸和不同的酰胺化合物可以在細胞內外產生。

4.結論

在180天的儲存過程中，養豬廢水TOC、TN和NH4-N含量顯著降低，NO3-N和NO2-N含量保持非常低，然而，溶解性有機氮（SON）含量顯著上升。存儲180天后，原始養豬廢水中總氮含量損失了36.1%，廢水中727.6mg/L的NH4-N發生了轉化，而儲存的養豬廢水中SON增加了202.6mg/L，這表明儲存過程發生了從NH4-N到SON的氮損失和氮轉化。另外，在不同的儲存時間內，反硝化作用和谷氨酸/谷氨酰胺合成酶的基因豐度始終最高，異化硝酸鹽還原、天冬酰胺合成和厭氧氨氧化的基因豐度中等，養豬廢水中反硝化和氨同化基因（如氨基酸和酰胺的合成）活性較高表明發生了顯著的氮同化作用。