土木香內酯上調miR-3178抑制膽管癌QBC939細胞增殖、遷移和侵襲

張玉勝 李稱才 陳博藝 余勇 王振龍 (湛江中心人民醫院肝膽外科,廣東 湛江 524000)

膽管癌是第二常見的原發性肝膽惡性腫瘤,具有發病隱匿、進展快、轉移快等特點〔1〕。化療是不能手術切除患者延緩病情進展的重要手段,但由于化學敏感性差、化療藥毒副作用較大,多數膽管癌患者預后較差,5年總生存率極低〔2〕。因此,尋找有效抑制膽管癌細胞增殖、轉移的藥物是治療膽管癌的關鍵。土木香內酯是從菊科植物土木香Inula helenium L.根中提取的萜類化合物,具有抗炎、保肝、清除自由基、抗癌等生物活性〔3〕。研究報道土木香內酯通過靶向轉錄因子(TF)EB破壞自噬-溶酶體通路,誘導胰腺癌細胞凋亡,提高化療敏感性〔4〕。此外,土木香內酯對乳腺癌細胞遷移、侵襲、黏附、增殖具有抑制作用〔5〕。然而,土木香內酯在膽管癌中的抗癌作用未見報道。微小RNA(miR)是一類長度約20個核苷酸的小分子RNA,其通過在轉錄后調控基因表達,參與調節細胞發育、分化、凋亡、增殖、轉移等細胞過程〔6〕。研究報道肝細胞癌腫瘤內皮細胞中miR-3178表達較低,過表達miR-3178可抑制肝細胞癌腫瘤內皮細胞增殖和轉移〔7〕。乳腺癌中miR-3178低表達與總生存率較差相關,過表達miR-3178通過抑制上皮間質轉化(EMT)抑制乳腺癌細胞遷移和侵襲〔8〕。然而,miR-3178在膽管癌是否具有抗癌作用仍然未知。因此,本研究旨在闡明土木香內酯、miR-3178對膽管癌細胞生物學行為的影響,并確定土木香內酯是否通過調控miR-3178表達發揮抗癌作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2018年1～12月在湛江中心人民醫院接受手術切除的39例膽管癌組織標本和癌旁組織標本(非癌組織),組織標本均由兩名病理學家確認。其中男24例,女15例,年齡45～75歲,中位年齡61歲。膽管癌患者術前均未接受任何抗腫瘤治療。本研究經醫院科研倫理委員會批準,患者均獲得書面知情同意。手術后立即將組織標本置于液氮中冷凍,然后在-80 ℃冰箱保存直到使用。

1.2細胞和試劑 人膽管癌細胞QBC939購自上海鈺博生物公司;土木香內酯(純度99.4%,批號110760-201811,土木香內酯先溶于二甲基亞砜配制50 mmol/L的母液備用,實驗時用培養基稀釋至所需濃度)購于中國食品藥品檢定研究院;Opti-MEM培養基、DMEM培養基購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000購自美國Thermo Fisher公司;miR-3178模擬物(mimics)、miR-3178抑制物(anti-miR-3178)及各自的陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC)由北京六合華大基因公司提供;細胞計數試劑盒(CCK-8)、miRNA熒光定量檢測試劑盒、NP-40裂解液、Trizol試劑購自北京百奧萊博生物公司;Transwell小室購自美國BD公司;小鼠E-cadherin單克隆抗體(sc-21791)、小鼠N-cadherin單克隆抗體(sc-8424)、小鼠GAPDH單克隆抗體(sc-47724)、山羊抗小鼠IgG二抗(sc-2005)購自美國Santa Cruz公司;miRNA逆轉錄試劑盒購自南京諾唯贊生物公司。

1.3細胞培養和分組 QBC939細胞接種在含有10%胎牛血清的DMEM培養基,放入含5% CO2、37 ℃培養箱培養。當細胞密融合度為80%時胰酶0.25%胰蛋白酶消化,1∶3比例傳代。將第五代對數期QBC939細胞接種24孔板,細胞密度為1×105個/孔,當細胞融合度為50%時進行轉染。按照Lipofectamine2000說明書將脂質體和無血清Opti-MEM培養基混勻;同時將待轉染序列與無血清Opti-MEM培養基混勻;室溫孵育5 min,將二者混合,室溫孵育20 min。取100 μl混合物加入24孔板各孔進行轉染,培養6 h后更換為含血清DMEM培養基,轉染48 h時收集QBC939細胞,實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)測定miR-548b的相對水平以驗證轉染效果。正常培養的QBC939細胞命名為對照組;用含1.25、2.50、5.00 μmol/L土木香內酯〔9〕培養液孵育QBC939細胞48 h,分別命名為土木香內酯低濃度(AL-L)組、土木香內酯中濃度(AL-M)組、土木香內酯高濃度(AL-H)組;轉染miR-NC、轉染miR-3178 mimics的QBC939細胞分別命名為miR-NC組、miR-3178組;用含5 μmol/L土木香內酯的培養液孵育轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-3178的QBC939細胞,分別命名為AL+anti-miR-NC組、AL+anti-miR-3178組。

1.4CCK-8法檢測細胞增殖 將未轉染QBC939細胞及轉染miR-NC、轉染miR-3178 mimics、轉染anti-miR-NC、轉染anti-miR-3178的QBC939細胞接種96孔板,每孔5×103個細胞,按照1.3分組給予對應濃度的土木香內酯置于培養箱孵育,48 h后每孔加入10 μl CCK-8工作液,培養箱繼續孵育2 h。用酶標儀測定各孔在450 nm處的吸光度值(A)。抑制率(%)=(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100%

1.5Transwell實驗檢測細胞侵襲 取各組QBC939細胞,分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,并把細胞懸浮在無血清的DMEM培養液中(細胞濃度為1×106個)備用。向包被基質膠的Transwell上室加入200 μl細胞懸浮,向24孔板下室中加入500 μl含10%胎牛血清培養基。培養箱孵育24 h后,用無菌棉小心擦去Transwell膜上表面細胞,4%多聚甲醛固定膜表面侵襲細胞30 min,0.1%結晶紫染液染色20 min。在顯微鏡下觀察QBC939細胞穿膜情況,以隨機5個視野內細胞數均值表示細胞侵襲數。

1.6劃痕愈合實驗檢測細胞遷移 每組取6×105個QBC939細胞接種6孔板,當細胞密度達到80%～90%時,用移液槍100 μl槍頭在細胞表面劃一條橫線。PBS漂洗除去細胞碎片。加入無血清培養基,放入培養箱培養。培養0、24 h時顯微鏡下拍照,測量劃痕寬度。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%

1.7平板克隆實驗檢測細胞克隆形成能力 每組QBC939細胞以每孔200個細胞的密度接種在6孔板中,輕輕轉動6孔板使細胞分散均勻。將6孔板置于常規培養箱中培養2～3 w。當6孔板中出現肉眼可見的克隆時,終止培養。棄去上清液,用PBS漂洗細胞兩次,用4%多聚甲醛固定細胞15 min,去除固定液,用0.1%結晶紫染液染色20 min。流水洗去染色液,空氣干燥。在顯微鏡下計數大于50個細胞的克隆數。

1.8Western印跡法檢測E-cadherin和N-cadherin蛋白表達 QBC939細胞處理完畢后,使用NP-40裂解細胞。每組QBC939細胞取40 μg蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),隨后濕轉法將分離的蛋白轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。將膜放入孵育盒,加入5%脫脂牛奶緩沖液封閉1 h,棄去封閉液、Tris緩沖鹽水-吐溫20(TBST)漂洗后用1∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過夜,TBST漂洗后用1∶3 000稀釋的山羊抗小鼠二抗室溫孵育1 h。加入化學發光底物使蛋白條帶顯色,以Imag J軟件測得的目的條帶和內參GAPDH條帶灰度值比值表示目的蛋白的表達量。

1.9RT-qPCR檢測miR-3178表達 Trizol試劑分離各組QBC939細胞及乳腺癌組織、癌旁組織的總RNA。測定RNA濃度合格后,按照miRNA逆轉錄試劑盒說明進行合成cDNA,再用miRNA熒光定量檢測試劑盒進行RT-qPCR。miR-3178相對水平檢測以U6為內參,采用2-ΔΔCt法計算。miR-3178上游5′-GGGGCGCGGCCGGATCG-3′,下游′5′-GCTGTC-AACGATACGCTACGTAACG-3′;U6上游5′-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3′,下游5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′。

1.10統計學方法 每組設置3個復孔,實驗重復3次。采用SPSS22.0軟件進行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1土木香內酯對膽管癌QBC939細胞增殖的影響 與對照組比較,AL-L、AL-M、AL-M組QBC939細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05),克隆形成數顯著降低(P<0.05)。隨著土木香內酯濃度的增加,其對QBC939細胞的增殖抑制作用逐漸增強,兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 土木香內酯對膽管癌QBC939細胞增殖、遷移、侵襲及miR-3178表達的影響

2.2土木香內酯對膽管癌QBC939細胞遷移、侵襲的影響 與對照組比較,AL-L、AL-M、AL-M組QBC939細胞劃痕愈合率、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。隨著土木香內酯濃度的增加,其對QBC939細胞遷移、侵襲、N-cadherin蛋白表達的抑制作用及對E-cadherin蛋白表達的促進作用均逐漸增強,兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1、圖1。

1～8:對照組、AL-L組、AL-M組、AL-H組、miR-NC組、miR-3178組、AL-anti-miR-NC組、AL-anti-miR-3178組圖1 各組遷移、侵襲相關蛋白表達

2.3土木香內酯對膽管癌QBC939細胞miR-3178表達的影響 與對照組比較,AL-L組、AL-M組、AL-M組QBC939細胞miR-3178相對水平顯著升高(P<0.05)。隨著土木香內酯濃度增加,其對QBC939細胞miR-3178表達抑制作用逐漸增強,兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4miR-3178過表達對膽管癌QBC939細胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較,miR-3178組QBC939細胞miR-3178相對水平、抑制率、E-cad-herin蛋白表達水平顯著升高(P<0.05),細胞克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

表2 miR-3178過表達對膽管癌QBC939細胞增殖、遷移侵襲的影響

2.5miR-3178在膽管癌組織中的表達 膽管癌組織中miR-3178的相對水平(0.34±0.03)較癌旁組織(1.00±0.08)顯著降低(n=39;t=48.241,P=0.000)。

2.6抑制miR-3178表達逆轉了土木香內酯對膽管癌QBC939細胞增殖、遷移和侵襲的作用 與AL+anti-miR-NC組比較,AL+anti-miR-3178組QBC939細胞miR-3178相對水平、抑制率、E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),細胞克隆形成數、劃痕愈合率、侵襲細胞數、N-cadherin蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖1、表3。

表3 干擾miR-3178表達逆轉了土木香內酯對膽管癌QBC939細胞增殖、遷移和侵襲的作用

3 討 論

近年來,天然化合物作為新型癌癥治療手段的潛力受到廣泛關注。土木香內酯已被證實在多種人類癌癥中表現出抗癌潛力。研究〔4〕表明土木香內酯處理后乳腺癌細胞形態由梭形變為圓形,細胞存活率明顯下降。Zhang等〔10〕指出土木香內酯可通過下調磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路抑制骨肉瘤細胞遷移和侵襲。Wang等〔11〕證實土木香內酯通過活性氧介導的內質網應激和AKT/糖原合成酶激酶(GSK)3通路增強肺癌細胞對吉西他濱的敏感性。此外,土木香內酯通過調控p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB通路促進胃癌細胞,并抑制細胞遷移〔12〕。本研究首次探討土木香內酯在膽管癌中的抗癌作用,結果表明,土木香內酯以濃度依賴方式抑制膽管癌細胞QBC939增殖、遷移和侵襲,這與Chun等〔5〕報道其在乳腺癌中抗癌作用一致。E-cadherin是腫瘤細胞表型的中樞調節因子,E-cadherin表達下調與其膽管癌陽性轉移狀態有關,下調E-cadherin表達可降低細胞黏附強度,促進膽管癌細胞遷移和侵襲,進而促進膽管癌進展〔13〕。本研究中,土木香內酯顯著下調間質表型蛋白N-cadherin表達,上調上皮表型蛋白E-cadherin表達,這與其對QBC939細胞的遷移和侵襲抑制作用一致。以上研究表明,土木香內酯對膽管癌細胞QBC939的惡性生物學行為具有抑制作用。

miR-3178是一種腫瘤相關miRNA,研究顯示乳腺癌中miR-3178表達改變可能與他莫昔芬耐藥有關〔14〕。miR-3178通過靶向腫瘤壞死因子相關受體因子(TRAF)3能夠改善幽門螺桿菌新毒素腫瘤壞死因子-α誘導蛋白(Tip-α)誘導的胃部炎癥和腫瘤發生〔15〕。特異性蛋白(Sp1)通過下調miR-3178促進低轉移性前列腺癌、肺癌和乳腺癌細胞的侵襲和轉移〔16〕。本研究發現膽管癌組織中miR-3178的相對水平顯著降低,提示miR-3178低表達可能有助于膽管癌進展。功能實驗表明,過表達miR-3178明顯下調N-cadherin蛋白表達,上調E-cadherin蛋白表達,抑制QBC939細胞增殖、遷移和侵襲。既往研究報道,中藥化合物可通過調控miRNA表達發揮抗腫瘤作用,例如姜黃素通過上調miR-143表達明顯抑制前列腺癌細胞增殖和遷移過程〔17〕。本研究發現,土木香內酯以濃度依賴方式增加QBC939細胞中miR-3178相對水平,且土木香內酯和過表達miR-3178的抗腫瘤效果類似,提示miR-3178可能介導土木香內酯的抗腫瘤作用。進一步研究顯示,抑制miR-3178表達部分逆轉土木香內酯對QBC939細胞增殖、遷移、侵襲、N-cadherin蛋白表達的抑制作用及對E-cadherin蛋白表達的促進作用,這表明土木香內酯通過上調miR-3178表達抑制膽管癌細胞QBC939的惡性生物學行為。然而,本研究僅進行了體外細胞實驗,后續將在動物模型中進一步驗證土木香內酯的抗腫瘤作用。

綜上,miR-3178在膽管癌中表達下調,土木香內酯通過上調miR-3178表達進而抑制膽管癌細胞QBC939增殖、遷移和侵襲,這初步揭示了土木香內酯的抗腫瘤分子機制,并可能為土木香內酯作為一種新型抗癌藥提供理論基礎。