薯蕷皂苷對缺血性腦損傷模型大鼠cAMP/PKA通路、NHE1和GLUTs蛋白的調控作用

李靜 馬俊遠 何雄文 鄭夢曉 胡曉鳳 牛美蘭

(1黃河科技學院醫學院,河南 鄭州 450000;2河南省中醫藥研究院附屬醫院)

缺血性腦卒中是血管狹窄或閉塞造成腦供血不足而引發的一種常見病,發病率高,死亡率高。除低糖和低氧外,組織酸化也是誘發缺血性腦損傷的重要病理因素之一〔1〕。葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)是葡萄糖跨膜轉運的重要載體,缺血性腦損傷會改變其表達及功能,導致葡萄糖轉運障礙,三磷酸腺苷(ATP)供應不足,蛋白質合成減少,血腦屏障通透性改變引發中樞神經損傷。1型Na+/H+交換蛋白(NHE1)可通過排出H+、移入Na+調控細胞內pH(pHi)和細胞容量〔2〕。文獻報道,缺血性腦損傷時NHE1被過度激活,加劇神經毒性和細胞水腫〔3,4〕。薯蕷皂苷是薯蕷科植物的主要活性成分之一,具有抗腫瘤、抗血小板聚集、減少心腦腎的缺血再灌注損傷等多種作用。文獻報道,薯蕷皂苷對大腦中動脈缺血(MCAO)大鼠具有高效的神經保護作用〔5〕。本研究旨在探索薯蕷皂苷對MCAO大鼠環腺苷酸(cAMP)/蛋白激酶(PK)A通路及NHE1、GLUTs蛋白的調控作用,為其臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只SD大鼠,SPF級,雄性,體質量280～350 g,購自河南省實驗動物中心,許可證號SCXK(豫)2017-0001,合格證號(NO201720584),飼養于標準實驗動物房。實驗均由鄭州大學倫理委員會批準進行。

1.2主要藥物、試劑及儀器 薯蕷皂苷(質量分數≥98%)由四川省維克奇生物科技有限公司提供;兔抗 NHE1 抗體、兔抗GLUTs抗體、小鼠抗GLUTs抗體、cAMP酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒、大鼠PKA-α ELISA試劑盒均購自武漢三鷹生物技術有限公司;其余試劑由sigma-aldrich公司提供。

1.3動物分組及復制MCAO模型 將60只大鼠隨機分為假手術(J)組、模型(MCAO)組、尼莫地平(N)組、薯蕷皂苷高劑量(H)、中劑量(M)、低劑量(L)組,每組10只。參照線栓法復制MCAO模型〔6〕,即用線栓阻塞大鼠右側大腦中動脈血流,結扎右側頸外動脈,切口縫合,持續栓塞2 h后輕輕拔出線栓。J組分離血管后縫合,不做其他操作。

1.4給藥 造模成功后大鼠經灌胃給藥7 d,H、M、L組分別給予20、10、5 mg/ml薯蕷皂苷溶液(10 ml/kg)灌胃,N組給予15 ml/kg尼莫地平灌胃,J組和M組給予等體積0.9%NaCl灌胃,均為1次/d。

1.5神經功能評分 參照文獻〔6〕,根據Longa標準對各大鼠進行神經功能評分。

1.6GLUTs和NHE1蛋白水平檢測 大鼠斷頭處死,取少量缺血腦皮質,提取總蛋白,對蛋白進行定量,常規法進行Western印跡操作,Odyssey紅外熒光掃描成像系統掃描Image Studio Lite Ver4.0分析圖像結果。β-actin為內參計算相對值,重復3次。

1.7腦脊液中cAMP、PKA含量檢測 取各組大鼠腦脊液樣本室溫平衡,ELISA檢測各組大鼠腦脊液中cAMP、PKA含量。

1.8統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行LSD-t檢驗、單因素方差分析及Studentt檢驗。

2 結 果

2.1各組神經功能評分 MCAO組較J組出現明顯的神經功能缺損(P<0.01),如左側前肢抓力減弱,轉圈等癥狀。N、H、M組較MCAO組神經病學癥狀顯著改善(P<0.01,P<0.05),L組較MCAO組癥狀有減輕,但差異無統計學意義(P>0.05)。M、L組改善效果顯著較N組差(P<0.05),H與N組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組神經功能評分、腦脊液中cAMP、PKA含量、腦皮質GLUTs、NHE1蛋白表達

2.2薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦脊液中cAMP、PKA含量的影響 MCAO組腦脊液中cAMP、PKA含量較J組顯著降低(P<0.01)。與MCAO組相比,N、L、M、H組cAMP、PKA含量升高,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05),H組cAMP、PKA含量與N組差異無統計學意義(P>0.05),L、M組顯著低于N組(P<0.01,P<0.05)。見表1。

2.3薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦皮質GLUTs蛋白表達水平的影響 與J組比較,MCAO組GLUTs表達顯著減少(P<0.01);與MCAO組相比,隨著薯蕷皂苷劑量的增加,GLUTs表達水平逐漸升高,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05);其中L、M組GLUTs表達水平較N組顯著降低(P<0.01,P<0.05),H組GLUTs表達水平與N組差異無統計學意義(P>0.05),見表1及圖1。

圖1 各組腦皮質GLUTs、NHE1蛋白表達

2.4薯蕷皂苷對MCAO大鼠腦皮質NHE1蛋白表達水平的影響 與J組比較,MCAO組NHE1表達顯著增加(P<0.01);與MCAO組相比,M、H組NHE1表達降低,差異有統計學意義(P<0.01,P<0.05),而L組無統計學差異(P>0.05);H組NHE1表達水平顯著較N組高(P<0.05),而L、M組無統計學差異(P>0.05),見表1及圖1。

3 討 論

薯蕷皂苷是甾體皂苷的一種,近年來發現其具有顯著的改善缺血性腦損傷的作用〔5〕。本研究結果提示薯蕷皂苷對MCAO模型大鼠有一定的神經保護作用。

cAMP是細胞信號傳導的最重要的第二信使之一,常和下游因子PKA形成cAMP/PKA信號系統。近來,細胞實驗和動物實驗證明 cAMP/PKA信號通路在缺血性腦損傷過程中通過維持星形膠質細胞和誘導血腦屏障的完整性發揮神經保護效應〔7,8〕。本研究提示,薯蕷皂苷可能通過上調cAMP/PKA信號通路,保護腦組織。

缺血性腦損傷的發生與血腦屏障的完整性及轉運蛋白表達異常密切相關〔9,10〕。現代醫學在缺血性腦損傷疾病的研究中,關于能量供應、血液循環、基因蛋白調控研究較多,但關于GLUTs和NHE1表達與缺血性腦損傷的關系報道甚少。腦的能量代謝過程中,葡萄糖的有氧氧化是其能量的主要來源,但是葡萄糖必須依賴GLUTs的幫助才能通過血腦屏障進入神經細胞。缺血性腦損傷破壞了血腦屏障的完整性,導致葡萄糖轉運障礙,而cAMP/PKA信號通路的上調能增強GLUTs的轉運功能〔11,12〕。本研究結果提示,薯蕷皂苷可能通過增強GLUTs的作用,逆轉缺血引起的腦內葡萄糖匱乏,保障腦細胞葡萄糖的供應,進而改善缺血性腦損傷的程度,此作用可能與cAMP/PKA信號通路的上調有關。

NHE1廣泛分布在哺乳動物的中樞神經系統中,能夠反向轉運Na+和H+,是神經元調節pHi的最普遍機制,被認為是治療缺血性腦損傷的有意義靶點〔13,14〕。缺氧會降低葡萄糖的糖酵解,使乳酸和H+形成,并向能量匱乏的腦細胞施加酸負荷,進而激活NHE1,導致Na+被轉運進入細胞,細胞內高Na+驅動Na+-Ca2+交換,使細胞內Ca2+濃度升高,形成胞內Ca2+超載,引起細胞內離子失衡,改變細胞容量和pHi,破壞血腦屏障,進而引發腦水腫及神經細胞損傷〔15,16〕。本研究提示,薯蕷皂苷可能通過抑制NHE1的作用,改善細胞內酸中毒,維持細胞內pH,保護腦組織。綜上,薯蕷皂苷可通過上調cAMP/PKA 信號通路、增強GLUTs表達水平、降低NHE1水平,來緩解缺血性腦損傷程度,保護腦組織。