利多卡因通過下調miR-4461抑制胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲

陳基勝 符明君 林玉美 (海口市第三人民醫院麻醉科,海南 海口 571138)

胃癌是一種起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,根據胃癌的總發病率和死亡率,其在惡性腫瘤中排名第二,是全球癌癥相關死亡的主要原因〔1～3〕。據2018年統計,全球新診斷胃癌病例103.3萬,死亡78.3萬〔4〕。吸煙、高鹽攝入、病毒感染和遺傳等因素可能與胃癌腫瘤的發生有關〔5〕。由于耐藥和高復發率等,患者的5年生存率低于30%〔6〕。利多卡因具有明顯的抗胃癌活性。利多卡因可抑制胃癌細胞惡性行為和增殖潛力〔7〕。利多卡因可抑制人胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導細胞凋亡〔8,9〕。微小RNA(miRNA)異常表達與腫瘤細胞的惡性生物學行為有關。研究表明,miR-4461可促進卵巢癌細胞的增殖和轉移〔10〕。但miR-4461在胃癌中的表達和作用及利多卡因的抗胃癌作用是否與miR-4461有關仍需探討。本研究旨在探討利多卡因對胃癌細胞惡性表型的影響及潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 人正常胃黏膜細胞GES-1及胃癌細胞AGS、N87、HGC-27和SNU-484(中國科學院上海細胞庫);miR-4461 inhibitor、miR-4461 mimic及其陰性對照(inhibitor-NC、miR-NC,上海吉瑪制藥技術有限公司);噻唑藍(MTT)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2細胞處理 將AGS細胞接種于6孔板中培養,分為對照組、利多卡因組(用含10 mmol/L利多卡因培養基培養)、anti-miR-NC組(轉染inhibitor-NC)、anti-miR-4461組(轉染miR-4461 inhibitor)、利多卡因+miR-NC組(轉染miR-NC后,用含10 mmol/L利多卡因培養基培養)、利多卡因+miR-4461組(轉染miR-4461 mimic后,用含10 mmol/L利多卡因培養基培養),轉染按照Lipofectamine2000試劑說明書進行。

1.3實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 從細胞中提取總RNA,并進行反轉錄合成cDNA,在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。采用2-ΔΔCt法計算miR-4461表達量。引物序列:miR-4461,上游:5′-GATTGAGACTAGTAGGGCTCGGC-3′,下游:5′-AGA-CTGGATGAGACTGTGACTTG-3′;U6,上游:5′-CTCG-CTTCGGCAGCACA-3′,下游:5′-AACGCTTCACGAA-TTTGCGT-3′。

1.4MTT 將各組AGS細胞接種于96孔板(2.5×103個細胞/孔),48 h后,加MTT溶液,4 h后加DMSO溶解結晶物,酶標儀檢測490 nm處OD值。

1.5Transwell 于Transwell小室的上室中接種100 μl AGS細胞懸液(無血清培養基重懸,細胞密度為5×105個/ml),下室加600 μl培養液(含10%胎牛血清),常規培養24 h后,取出小室,穿膜細胞用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色20 min,光學顯微鏡下計數穿膜細胞數。在細胞侵襲中,使用包被Matrigel的上室,其余操作同上。

1.6Western印跡 RIPA裂解液提取總蛋白,十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白樣品(60 μg)并轉膜,將膜封閉后,與一抗細胞周期蛋白(Cyclin)D1(1∶2 000)、p21(1∶500)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2(1∶1 000)、MMP-9(1∶1 000)、GAPDH(1∶2 000)孵育24 h,洗去一抗,室溫下將膜與二抗(1∶4 000)孵育2 h,顯影,分析蛋白條帶灰度值,計算蛋白表達量。

1.7統計學分析 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗、方差分析。

2 結 果

2.1胃癌細胞中miR-4461表達比較 與人正常胃黏膜細胞GES-1(1.00±0.06)比較,胃癌細胞AGS、N87、HGC-27和SNU-484中miR-4461表達水平顯著升高(3.15±0.29、2.79±0.32、2.37±0.23、2.19±0.25,F=98.308,P=0.000)。

2.2不同濃度利多卡因對胃癌AGS細胞存活率的影響 與對照組〔(100.00±7.26)%〕比較,1、5、10、20 mmol/L利多卡因均AGS細胞存活率顯著降低〔(81.28±5.23)%、(65.47±3.58)%、(51.23±4.12)%、(48.12±7.16)%;F=176.092,P=0.000〕,且10、20 mmol/L利多卡因處理后的細胞存活率約為50%,故后續實驗選擇10 mmol/L利多卡因。

2.3利多卡因對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與對照組比較,利多卡因組AGS細胞OD值、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白水平明顯降低,p21蛋白水平明顯升高(P<0.001)。見圖1、表1、圖2。

表1 利多卡因對AGS細胞增殖、遷移、侵襲、CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達、miR-4461表達的影響

1～6:對照組、利多卡因組、anti-miR-NC組、anti-miR-4461組、利多卡因+miR-NC組、利多卡因+miR-4461組圖1 各組CyclinD1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達

圖2 各組細胞遷移和侵襲(結晶紫染色,×200)

2.4利多卡因對胃癌AGS細胞中miR-4461表達的影響 與對照組比較,利多卡因組miR-4461表達水平明顯降低(P<0.001)。見表1。

2.5下調miR-4461對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 轉染anti-miR-NC、anti-miR-4461后,anti-miR-4461組miR-4461表達水平明顯低于anti-miR-NC組,說明轉染成功;與anti-miR-NC組比較,anti-miR-4461組AGS細胞OD值、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平明顯降低,p21水平明顯升高(P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

表2 下調miR-4461對胃癌AGS細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響

2.6過表達miR-4461逆轉了利多卡因對胃癌AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與利多卡因+miR-NC組比,利多卡因+miR-4461組miR-4461表達水平、OD值、遷移和侵襲細胞數、CyclinD1、MMP-2、MMP-9水平明顯升高,p21水平明顯降低(P<0.05)。見圖1、圖2、表3。

表3 過表達miR-4461逆轉了利多卡因對胃癌AGS細胞增殖、遷移、侵襲及相關蛋白表達的影響

3 討 論

利多卡因可用于多種急性或慢性疼痛疾病,如神經性疼痛、炎癥和傷害性疼痛〔11,12〕。且研究發現,利多卡因具有抗癌作用,如利多卡因可抑制乳腺癌細胞的存活和遷移〔13〕。利多卡因可抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲,誘導凋亡〔14〕。利多卡因可抑制人卵巢癌A2780和SKOV3細胞的生長、上皮間質轉化(EMT)、遷移和侵襲,并可增強小鼠卵巢轉移模型中的順鉑化療敏感性〔15〕。利多卡因可抑制結直腸癌細胞活力和有氧糖酵解,促進體外細胞凋亡,抑制體內腫瘤生長〔16〕。利多卡因可抑制宮頸癌HeLa細胞活力,促進細胞凋亡〔17〕。與上述抗癌作用一致,本研究結果提示利多卡因具有抗胃癌作用。

研究表明,miRNA與胃癌的發生發展密切相關。如miR-552高表達預示胃癌患者預后不良,上調miR-552可提高胃癌細胞活力、轉移和EMT能力,并通過靶向負調控叉頭狀轉錄因子(FOX)O1表達促進胃癌進展〔18〕。miR-1301-3p在胃癌中呈高表達,其可通過靶向下調沉默信息調節因子(SIRT)1促進胃癌細胞體內生長〔19〕。miR-653-5p通過下調細胞因子信號抑制分子(SOCS)6促進胃癌細胞的增殖和轉移〔20〕。在胃癌組織和細胞中,miR-196b表達上調,下調miR-196b通過靶向上調食管癌相關基因(ECRG)4抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔21〕。miR-1180在胃腺癌組織中表達上調,其高表達與胃癌患者預后不良有關,且可促進胃癌進展〔22〕。與上述研究結果相似,本研究結果提示miR-4461在胃癌中發揮促癌作用,下調miR-4461可抑制胃癌進展。

近年來,多項研究發現,利多卡因通過調控miR表達發揮抗癌作用。如利多卡因可通過上調miR-520a-3p抑制EGFR表達,誘導大腸癌細胞凋亡,并抑制其增殖〔23〕。在肝癌細胞中,過表達miR-15a-5p可增加細胞凋亡,抑制細胞遷移和侵襲,利多卡因通過調控miR-15a-5p表達誘導細胞凋亡,抑制遷移和侵襲〔24〕。在卵巢癌和乳腺癌中,利多卡因通過調控miR-382-5p/SLC7A11軸促進卵巢癌和乳腺癌細胞鐵死亡〔25〕。此外,利多卡因被報道可通過上調miR-145抑制胃癌細胞的惡性生物學行為〔26〕;且利多卡因可通過降低miR-10b表達增強胃癌MGC-803/DDP細胞對順鉑的敏感性〔27〕。本研究結果提示利多卡因的抗胃癌作用可能與下調miR-4461表達有關。