甲狀腺激素受體在阿爾茨海默病PC12細胞模型中異常表達

任炳秀 王欣 周呈義 靖功偉 陶敏 麻錦心 王嬌亞 葉梅

(遵義醫科大學第三附屬醫院(遵義市第一人民醫院) 1核醫學科,貴州 遵義 563002;2醫院感染管理科)

阿爾茨海默病(AD)是最常見的神經系統退行性疾病,主要表現為進行性記憶障礙,研究表明β-淀粉樣蛋白(Aβ)和過度磷酸化的tau是AD的核心病理物質〔1〕;既往研究顯示,甲狀腺激素在大腦學習和記憶中起重要作用〔2〕,但AD與甲狀腺功能異常之間的關系目前仍不清楚,尤其是在甲狀腺功能異常誘發和(或)加重了AD還是AD誘發甲狀腺功能異常方面目前還不清楚。因此本研究以PC12細胞作為研究對象,在體外培養條件下以岡田酸(OA)誘導PC12細胞tau磷酸化以建立AD細胞模型,并對細胞表達甲狀腺激素受體表達情況檢測,觀察AD病理變化對PC12細胞甲狀腺激素受體蛋白及基因表達的影響。

1 資助與方法

1.1主要實驗材料 未分化PC12細胞(南京金斯瑞生物科技有限公司),OA (Sigma-Aldrich Biotech Co.Ltd.),甲狀腺激素受體(THRα,β)PCR試劑盒(yeasen Biotech Co.Ltd.),Western印跡所有抗體、試劑(南京金斯瑞生物科技有限公司),細胞培養基、馬血清(15%)胎牛血清(2.5%;Gibco,Invitrogen,USA),噻唑藍(MTT)及二甲基亞砜(DMSO)(Beijing labgic Technology Co.Ltd.),神經生長因子(NGF,ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.),MTT檢測試劑盒(Sigma-Aldrich Biotech Co.Ltd.)。

1.2主要實驗儀器 生物安全柜(Jinan Biobase Biotech Co.td),ABI7500 Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems,Co.td,USA),Multiskan FC酶標儀(Thermo Scientific,Co.Ltd.),免疫熒光顯微鏡檢測系統(NOVA View,INOVA Diagnostics,Inc.)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀和轉膜儀(Jinan Biobase Biotech Co.td)。

1.3PC12細胞的培養及OA誘導實驗 將PC12細胞按1×104/ml 10 ml接種于75 cm2塑料培養瓶中,于37 ℃含20%CO2的培養箱內進行培養,培養基含90%的高糖DMEM、5%馬血清、5%胎牛血清、0.01%谷氨酰胺組成。培養5～10 d后,經0.25%胰蛋白酶消化(37 ℃,5 min)傳代,以1×104/ml 10 ml接種于75 cm2塑料培養瓶中進行擴增培養。將PC12細胞分為6組,每組6瓶,分別加入0、10、20、30及40 nmol/L的OA,繼續培養24 h后更換新鮮不含OA的培養液繼續培養1 w,消化離心棄去培養液、加入含5%MTT的培養液,置于5 ml EP管中繼續培養4 h,移去上清液,每管加入1 ml二甲基亞砜(DMSO),置于搖床上低速搖蕩10 min,在酶聯免疫檢測儀上檢測細胞在490 nm處的吸光值。

1.4PC12細胞AD模型驗證 根據MTT試驗結果,選擇濃度為0 nmol/L作為對照組、30及40 nmol/L OA為處理組細胞作為研究對象,收集相應組別細胞分別檢測Aβ(Western印跡和免疫熒光法)磷酸化tau(P-tau)、PP2A和酪氨酸307磷酸化的PP2A(PP2Ac-yp307)的表達情況以驗證細胞模型是否成功。

1.5OA處理后PC12細胞甲狀腺激素受體相關蛋白及基因表達情況檢測 分別收集對照組、OA濃度為30及40 nmol/L OA為處理組細胞(每組6瓶)檢測細胞甲狀腺激素受體(THR)α,β的蛋白(Western印跡)及基因(Real-time PCR)表達情況。

1.6圖像分析及數據統計學處理 使用ImageJ軟件對圖像的灰度值進行定量分析,所有數據采用SPSS18.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1MTT結果 與對照組〔(99.23±0.85)%〕比較,經30及40 nmol/L OA處理24 h后存活細胞明顯降低〔(68.76±1.59)%、(51.11±2.68)%,P<0.001〕,且光密度(OD)值(0.16±0.01、0.12±0.01)較對照組(0.22±0.01)明顯降低(P<0.001)。

2.2PC12細胞AD模型鑒定果 Western印跡及免疫熒光結果均顯示,經30、40 nmol/L OA處理后,PC12細胞的Aβ蛋白表達明顯高于對照組,其熒光表達強度也明顯高于對照組,40 nmol/L OA組Aβ蛋白表達明顯高于30 nmol/L OA組(P<0.01,P<0.000 1),見圖1、圖2、表1。與對照組比較,30、40 nmol/L OA組PP2AC-yp307、p-tau(ser396/404)、p-tau(Thr231)、tau-5表達明顯升高而PP2A表達明顯降低;40 nmol/L OA組PP2A、p-tau(ser396/404)明顯低于30 nmol/L OA組,但實驗組之間tau-5表達無明顯差別。見表1、圖3。

表1 各組Aβ蛋白、P-tau、PP2A、PP2Ac-yp307表達比較

圖1 Western印跡檢測PC12細胞表達Aβ蛋白

圖2 各組PC12細胞Aβ蛋白(免疫熒光法,×50)

圖3 Western印跡檢測各組tau磷酸化結果

2.3PC12細胞甲狀腺激素受體相關蛋白及基因表達結果 PC12細胞經30、40 nmol/L OA處理后,THRα、β表達均明顯升高,且40 nmol/L OA組THRα,β表達明顯高于30 nmol/L OA組(P<0.01,圖4,表2);與對照組比較,40 nmol/L OA組細胞THRα、β基因明顯升高(P<0.05),30 nmol/L組THRα基因表達無明顯變化(P>0.05),但THRβ基因表達明顯升高(P<0.05),30、40 nmol/L OA組間THRα、β基因表達無顯著差異(P>0.05)。見表3。

表2 各組PC12細胞表達THRα、β蛋白

表3 各組PC12細胞表達THRα、β基因表達

圖4 Western印跡檢測各組PC12細胞表達THRα、β蛋白

3 討 論

PC12細胞是大鼠腎上腺髓質嗜鉻瘤分化細胞株,具神經內分泌細胞的一般特征,因其具可傳代特點,廣泛應用于神經生理和神經藥理學研究〔3〕,岡田酸可使神經元細胞發生淀粉樣變性和誘導tau蛋白過度磷酸化而常被用于制備細胞及動物阿爾茨海默病(AD)模型的化學試劑〔4〕,本實驗所使用OA濃度在20～40 nmol/L時細胞的存活率與文獻〔3,4〕所報道基本相似。研究結果與以往研究結果相符〔5〕。

血清甲狀腺激素水平與AD病情的相關性方面的研究目前已有很多報道,但研究結論并不一致〔6,7〕;但在甲狀腺激素與大腦學習記憶的相關性方面,目前國內外學者已有大量研究,且結論基本一致〔8,9〕,有研究表明AD患者腦組織中THRα、β表達異常升高與現神經絲氨酸激酶升高具有相關性〔10〕,這些發現為甲狀腺激素紊亂和老年癡呆癥之間的潛在關系提供了證據,本研究結果提示,在AD發生發展過程中可能存在腦組織局部甲狀腺受體異常,但需要進一步的動物模型研究。

甲狀腺激素(TH)有兩種活性形式,三碘甲狀腺原氨酸(T3)和四碘甲狀腺原氨酸或甲狀腺素(T4),T4的半衰期長于T3,被認為是循環中主要的TH形式。從TH總產量中,93%為T4,7%是T3〔11〕,T4在血清中與蛋白質結合或以游離形式游離T4(FT4)。當T4在組織中時,它被脫碘酶轉化為T3,這被認為是TH的代謝活性形式,或反T3(rT3),這是一種滅活的形式〔12〕,最后,T3與其核THR結合,然后靶基因被抑制或激活〔13〕;文獻報道,T3可抑制神經母細胞瘤細胞中淀粉樣前體蛋白基因的表達,且T3負調控淀粉樣前體蛋白基因表達〔14〕,在AD細胞模型中,Aβ蛋白表達明顯增加,需要更多的T3進入細胞內,因此THR表達上調,此結果與既往臨床報道在AD尸檢中發現腦組織THR升高的結果相一致〔15〕。在30 nmol/L OA處理組有THRβ基因表達上調,而40 nmol/L OA處理組中THRα、β表達均上調,但兩組甲狀腺激素受體基因表達之間無明顯差別,其可能原因與兩組間OA濃度差偏小有關。