芬戈莫德對抑郁大鼠行為學及單胺類神經遞質的影響

張玲 張磊 王建楠 劉思蕓 隋汝波

(錦州醫科大學 1附屬第一醫院神經內科,遼寧 錦州 121000;2護理學院;3研究生院)

抑郁癥在世界范圍內的患病率為4%左右,在我國,這一比例高達5%～6%,受各種內外因素的影響,近年來該病的發病率不斷上升〔1〕。目前抗抑郁藥主要為5-羥色胺再攝取抑制劑及三環類藥物,僅僅為補充單胺類神經遞質的減少,本質上為對癥治療,治標不治本,且療效不一〔2,3〕,所以進一步尋找新的治療途徑至關重要。在抑郁癥發生發展過程中,炎癥因子發揮著重要作用,主要表現為炎癥反應系統的激活〔4,5〕。研究顯示〔6〕,環氧化酶-2抑制劑塞來昔布可用于抗抑郁,但由于該種藥物的作用僅局限于炎癥反應的單一靶點,因此抗抑郁效果十分有限。而主要作用于T淋巴細胞的1-磷酸鞘氨醇受體調節劑芬戈莫德(FTY720)可以抑制炎癥反應中的上游因素〔7〕,因此在抑制炎癥反應方面更加有效。FTY720主要發揮T淋巴細胞從次級淋巴器官遷出的抑制作用,可以降低促炎因子水平,此外還能否減少腦內炎癥細胞浸潤,改善由慢性溫和不可預知應激所致的抑郁尚不明確〔8,9〕。本實驗選用FTY720進行免疫干預,采用行為學、分子生物學、組織病理學等實驗方法,探討FTY720對大鼠抑郁行為的影響及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1材料 實驗動物:由錦州醫科大學實驗動物中心提供,50只SPF 級SD大鼠〔動物許可證號 SCXK(遼)2017-0006〕,雄性,平均體質量(200±15)g。

1.2實驗前準備 ①適應性喂養。于錦州醫科大學 SPF 動物實驗室適應性喂養1 w。②所有大鼠開展敞箱實驗和糖水消耗實驗。③測量基線體質量。④選取體質量和行為學指標等基線值均衡可比大鼠為試驗大鼠。總共50只。本試驗開展前獲得錦州醫科大學倫理委員會批準。

1.3實驗試劑及儀器 由美國Sigma公司提供FTY720,蘇州禮來制藥有限公司提供鹽酸氟西汀膠囊,沈陽萬類生物有限公司提供兔抗大鼠去甲腎上腺素(NE)抗體、兔抗大鼠白細胞介素(IL)-1β抗體、兔抗大鼠IL-6抗體、兔抗大鼠多巴胺(DA)、兔抗大鼠腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G及5-羥色胺(HT)抗體。美國R&D公司提供酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒。德國Leica公司提供RM2235型石蠟切片機,日本Olympus公司提供BX53型顯微鏡,美國Biotek公司提供ELX-800型酶標儀。

1.4動物分組及造模 實驗大鼠按照隨機數字表法分為慢性不可預見的溫和性應激(CUMS)組,對照(Con)組,FTY720低、中、高劑量(FTY-L、FTY-M、FTY-H)組,每組10只。除Con組外,其余各組均建立抑郁模型〔10〕,給予大鼠禁食水、潮濕墊料、傾籠、行為限制、晝夜顛倒、4 ℃冰浴游泳、電擊足底、夾尾等9種刺激方法,建模大鼠每天進行1種刺激,刺激方式在上述9中方法中隨機選取1種,共刺激3 w。在進行上述刺激前1 d,各組均分別腹腔注射給藥,其中Con組和CUMS組均給予等體積去離子水,FTY-L組、FTY-M組和FTY-H組分別給予0.5、1.0、2.0 mg/kg FTY720。

1.5體質量 共進行4次體質量測量,測量時間為刺激前1 d、刺激后第8、15及22天。

1.6糖水消耗 根據文獻〔7〕方法,對造模大鼠給予蔗糖水(濃度為1%)75 ml,并同時給予75 ml蒸餾水,觀察并記錄大鼠行為,1 h后,將上述蔗糖水和蒸餾水取出,測量并記錄大鼠消耗的水量,并由此推算大鼠糖和水的消耗比例。

1.7敞箱實驗 參照標準試驗方法〔11〕,所使用的敞箱為自制箱,箱壁為黑色,底部為白色,且無需加蓋(箱子長和寬均為80 cm,高50 cm)。在箱子的底部用黑色筆劃分25個等格,再將各大鼠置于所劃分的中心方格內。在5 min時間內,觀察并記錄大鼠穿越格數和兩后肢直立次數,上述記錄值分別代表大鼠的水平和垂直運動得分。

1.8蘇木素-伊紅(HE)染色 實驗動物造模完成后,各大鼠取血,迅速采用4%多聚甲醛于心臟進行灌注固定,并取大鼠大腦的海馬組織,先后經過脫水、透明、浸蠟與包埋步驟制作海馬組織蠟塊,并常規切片,HE染色觀察大鼠海馬組織形態學改變。

1.9Western印跡 造模完畢且大鼠取血后,將大鼠斷頭取腦,于冰塊上分離大鼠的海馬組織,然后加入200 μl RIPA裂解液〔含1 mol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)〕,于冰塊上研磨成組織勻漿,4 ℃ 12 500 r/min離心15 min后取上清,依照二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說明書進行蛋白定量。蛋白定量完成后開展聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。加入一抗前,利用脫脂牛奶(濃度為5%)進行封閉。一抗成分為:兔抗大鼠DA(1∶300)、兔抗大鼠5-HT(1∶500)、兔抗大鼠NE(1∶500)。加入一抗后設定溫度為4 ℃,搖床24 h,TBST緩沖液洗滌,按10 min/次的頻率共洗滌3次,加入HRP標記的羊抗兔(1∶5 000)二抗,室溫孵育2 h。按5 min/次的頻率采用TBST緩沖液進行洗滌,共洗滌3次,電化學發光,灰度分析采用ImageJ軟件。

1.10ELISA 抑郁造模完畢后經腹主動脈取血,12 500 r/min離心,離心后取上清,待測。嚴格按試劑盒說明書開展ELISA。A450 nm應用酶標儀進行檢測,最后計算相應樣本濃度,主要根據標準曲線開展。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、q檢驗。

2 結 果

2.1實驗動物一般狀態 Con組進食水情況較好,鼠毛順滑無脫落,較活躍。CUMS組進食減少,體質量增長緩慢,鼠毛毛躁且脫毛嚴重,活動量銳減。FTY-L、FTY-M、FTY-H組進食水略差,鼠毛基本無脫落,活動量尚可。

2.2體質量情況 Con組體質量變化與飼養時間有關,時間越長其體質量增加越多(P<0.05)。CUMS組體質量增長緩慢,僅刺激后第22天與刺激前比較差異有統計學意義(P<0.05)。CUMS組和FTY-L、FTY-M、FTY-H組體質量在刺激后第8、15、22天均顯著低于Con組(P<0.05);FTY-L組體質量在刺激后第22天顯著高于CUMS組(P<0.05);FTY-M、FTY-H組體質量在刺激后第15、22天顯著高于CUMS組(P<0.05)。見表1。

表1 各組不同時間體質量及水平運動、垂直運動得分、糖水消耗比例情況

2.3敞箱實驗及糖水消耗實驗 與Con組的水平運動、垂直運動得分及糖水消耗比例相比,CUMS組上述各指標顯著更低(P<0.05);與CUMS組相比,FTY-M、FTY-H組水平運動、垂直運動得分及糖水消耗比例顯著更高(P<0.05)。見表1。

2.4大鼠海馬組織形態學改變 HE染色結果表明,Con組海馬組織各區神經元形態完整而飽滿,神經元排列致密且有序;CUMS組CA1區神經元表現萎縮,神經元排列紊亂且稀疏,核固縮等凋亡現象;FTY-M及FTY-H組神經元排列緊密有序,細胞形態飽滿,核固縮等細胞凋亡現象顯著減少,見圖1。

圖1 各組海馬組織形態學(HE染色,×400)

2.5大鼠海馬組織DA、5-HT及NE表達水平 與Con組相比,CUMS組海馬組織中DA、5-HT及NE表達明顯下降(P<0.05);與CUMS組相比,FTY-M及FTY-H組DA、5-HT及NE表達明顯升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組海馬組織DA、5-HT及NE表達及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

2.6大鼠血清中IL-1β、IL-6及TNF-α比較 與Con組比較,CUMS組血清IL-1β、IL-6及TNF-α含量明顯上升(P<0.05);與CUMS組比較,FTY-L、FTY-M、FTY-H組血清中IL-1β、IL-6及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討 論

本實驗結果表明,大鼠抑郁模型造模成功;給予FTY720后,盡管不能完全恢復到Con組水平,但抑郁大鼠的體質量增長率在一定程度上有所增加,且可顯著提高大鼠行為學評分,即改善抑郁大鼠食欲減退、快感缺失、運動下降和探索行為下降等抑郁核心癥狀。綜上,本實驗結果證實應用FTY720可顯著改善大鼠抑郁行為。

本研究進一步實驗結果顯示,抑郁大鼠的海馬組織有嚴重的神經元損傷現象,且主要集中于CA1區,而FTY720則可以抑制這種現象的發生。其可能是因為,海馬在學習及情感表達過程中發揮重要作用。此前相關研究表明,抑郁大鼠的海馬神經元多半會出現再生障礙,且隨著再生障礙程度的不斷加深,海馬神經元甚至會出現凋亡,此時便會發生抑郁〔12〕。據此推測,FTY720發揮改善大鼠抑郁行為正是通過改善抑郁大鼠海馬組織神經元損傷而實現的。雖然目前缺乏相關研究,但有研究已證實FTY720對自閉癥及阿爾茨海默病模型的海馬組織神經元具有保護作用〔13,14〕。

DA、NE和5-HT均是抑郁癥單胺類神經遞質機制中重要組成部分,其中NE可參與機體多種生理功能的調節,如調節心血管活動、情緒、體溫,此外,NE還參與機體的記憶與學習能力,并影響人體的睡眠與覺醒,還影響人體對痛覺與焦慮的感知等。當NE功能下降時,中樞神經系統中NE含量表達下降,則可引發抑郁癥。5-HT是一種抑制性神經遞質,其生理作用表現為副交感神經節前纖維被抑制,而交感神經節前纖維被興奮。這種生物學作用,可以使其參與多項中樞神經運動,如情緒控制,還可以調節人體的睡眠,并影響機體的攝食行為,還影響人體的焦慮等負面情緒及性行為的發生等。而當機體處于應激狀態時,5-HT的水平將隨之發生變化,上述各種中樞神經運動也受到影響,由此便發生抑郁癥等精神類疾病。多巴胺能中邊緣獎賞系統的改變可能導致快感缺失〔15〕。所以DA、5-HT及NE的表達水平亦是反映抑郁現象的特異性指標。而5-HT再攝取抑制劑等抗抑郁藥物通過提高5-HT的水平來達到抗抑郁治療效果,本實驗結果表明FTY720同樣能夠通過提高DA、5-HT及NE的含量達到抗抑郁的治療效果。

單胺類神經遞質及神經營養因子(BDNF)的降低均可導致抑郁發生。而炎癥因子IL-1β、IL-6與TNF-α增多可過度激活下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸,此過程可升高糖皮質激素水平〔16〕, 同時由于激活了吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)使邊緣系統受到影響,神經遞質5-HT和DA水平隨之下降,并可以抑制膠質細胞釋放BDNF〔17〕,這提示,炎癥系統的激活可造成單胺類神經遞質降低,其為抑郁的始動因素,也是疾病發生發展的主要因素。如果能通過免疫干預減輕炎癥反應必然會減少單胺類神經遞質及BDNF的下降,這是治療抑郁的根本。目前免疫抑制治療抑郁的研究仍然較少,有限的研究〔18〕顯示,英夫利昔單抗為一種TNF-α拮抗劑,可以抑制炎癥指標水平,從而緩解患者的抑郁癥狀。本研究結果顯示,FTY720通過降低IL-1β、IL-6與TNF-α水平同樣能夠提高單胺類神經遞質表達,與此同時還可以改善海馬神經元損傷,最終實現抑郁治療。

綜上,FTY720能夠有效改善海馬神經元損傷并增加DA、5-HT和NE的表達進而緩解大鼠的抑郁行為,其機制可能是通過降低IL-1β、IL-6與TNF-α水平實現的。本團隊下一步研究的重點為進一步探索FTY20是否能夠治療血管性癡呆,以期為臨床提供更多更有力的證據。