人參皂苷Re、燈盞花素組合物對血管性癡呆大鼠的神經保護作用

陳欣悅 宋冬冬 趙晴 (吉林大學中日聯誼醫院南湖神經內科,吉林 長春 130000)

血管性癡呆(VD)通常由腦血管疾病所引起,它是導致老年癡呆的一個重要原因。但VD發病機制復雜,現有研究對其具體發病機制尚未完全明確。中醫藥對VD的防治具有重要價值。人參皂苷Re的抗炎〔1〕和抗氧化〔2〕及對海馬體中腦源性神經營養因子和可塑性相關蛋白的正向調節使其可發揮神經保護作用,對抗認知功能障礙〔3〕。燈盞花素有抗血栓形成、抗氧化、抗細胞凋亡〔4〕、清除氧自由基、抑制血小板聚集等作用,可有效減少炎癥細胞因子、降低氧化應激和促凋亡蛋白表達〔5〕,對腦缺血損傷帶來的認知功能障礙具有顯著改善作用〔6〕。本文旨在探討人參皂苷Re與燈盞花素組合物對VD大鼠的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取健康SPF級成年雄性SD大鼠64只,體質量為190～210 g。實驗動物由遼寧長生生物技術股份有限公司〔許可證號:SCXK(遼)2020-0001〕提供,保持12 h的明暗循環,適應性飼養7 d。人參皂苷Re與燈盞花素均購自天馬(安徽)國藥科技有限公司,血塞通膠囊購自云南維和藥業股份有限公司,注射用青霉素鈉購自山東魯抗醫藥股份有限公司。

1.2動物模型制備及分組 采取永久性結扎雙側頸總動脈法制備VD大鼠模型,假手術組采用頸部正中切口鈍性分離,僅分離暴露出雙側頸總動脈但不結扎,其他處理同模型組。術后2 w,行Morris水迷宮篩查實驗,將伴有游泳障礙的大鼠剔除。隨機選取其中造模成功的大鼠64只,遵循體質量均衡原則分為假手術組、模型組、陽性藥組(42 mg/kg血塞通膠囊每日10 ml/kg體積)、組合物低劑量組(人參皂苷Re 2.5 mg/kg+燈盞花素1 mg/kg每日10 ml/kg體積)、組合物中劑量組(人參皂苷Re 5.0 mg/kg+燈盞花素2 mg/kg每日10 ml/kg體積)、組合物高劑量組(人參皂苷Re 10.0 mg/kg+燈盞花素4 mg/kg每日10 ml/kg體積)、人參皂苷Re組(10 mg/kg每日10 ml/kg體積)、燈盞花素組(4 mg/kg每日10 ml/kg體積),每組8只。術后給予正常進食飲水并腹腔注射青霉素〔8萬U/(kg·5 ml)〕3 d預防術后感染,3 d后除假手術組和模型組外,各組術后灌胃給予相應藥物(每日1次),持續28 d,假手術組和模型組給予等體積純凈水(10 ml/kg)。

1.3Morris水迷宮實驗 各組給藥28 d結束后,每組大鼠在水迷宮實驗前有1 d的適應性訓練。在適應性訓練后的第2天,使用Morris水迷宮對大鼠進行行為學檢測。Morris水迷宮實驗由5 d的定位航行試驗及1 d的空間探索實驗構成,兩者分別對大鼠的空間學習、記憶能力進行檢測。

1.3.1定位航行試驗 連續5 d于上午固定時間段將各組大鼠隨機從任一象限起始點作為入水點,頭朝向池壁放入水中,讓大鼠在水中自由游動。當天的逃避潛伏期是指大鼠找到平臺的時間(60 s內未找到平臺則按60 s計算),取3次平均值。若大鼠可以在60 s內成功爬上平臺,則讓其在平臺上停留10 s以強化記憶。若大鼠在60 s內不能找到平臺,則將大鼠帶到平臺上停留10 s再按順時針方向由下一象限入水進行實驗。

1.3.2空間探索實驗 空間探索實驗于定位航行試驗結束24 h后開始進行,需要將平臺撤去。實驗需要將大鼠頭朝池壁放入第Ⅰ象限入水點,記錄60 s內大鼠穿越平臺次數。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠斷頭取海馬組織,于10%甲醛溶液中固定,常規石蠟切片,HE染色,于光學顯微鏡下(×400)觀察大鼠海馬區細胞的形態學改變。

1.5海馬組織細胞因子含量 應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定大鼠海馬組織內白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α含量。

1.6統計學處理 采用SPSS22.0軟件行t檢驗。

2 結 果

2.1Morris水迷宮結果

2.1.1定位航行試驗結果 模型組逃避潛伏期比假手術組顯著延長(P<0.001),VD動物模型復制成功。與模型組比較,陽性藥組在定位航行試驗第1天,逃避潛伏期差異無顯著性(P>0.05)。從第2天開始,陽性藥組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.01,P<0.05,P<0.001)。組合物低劑量組逃避潛伏期僅有降低趨勢,但無顯著差異(P>0.05)。組合物中、高劑量組及燈盞花素組逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。人參皂苷Re組逃避潛伏期在訓練第1、2、5天明顯縮短(P<0.05),而第3天及第4天兩組逃避潛伏期無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 人參皂苷Re、燈盞花素組合物對VD大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數的影響

2.1.2空間探索試驗結果 模型組穿過平臺次數比假手術組顯著減少(P<0.01)。與模型組比較,陽性藥組、組合物高劑量組過平臺次數明顯增加(P<0.05)。組合物低劑量組、組合物中劑量組、人參皂苷Re組、燈盞花素組穿過平臺次數無顯著變化(P>0.05)。見表1。

2.2大鼠海馬組織細胞形態觀察 假手術組中錐體細胞體積較大,胞質豐富,細胞核清晰飽滿,可見清晰的核染色質,錐體細胞分布數量較多,極少見到細胞發生胞質固縮現象。模型組中錐體細胞分布數量減少,細胞胞質含量下降,核染色質不清;多見錐體細胞發生固縮現象,固縮細胞整體皺縮,胞體染色變深,胞質和細胞核區分不清。與模型組比較,陽性藥組錐體細胞損傷狀態有減輕,錐體細胞胞質豐富度增加,發生固縮的大腦神經細胞數量減少;組合物低劑量組可見組織內分布固縮的神經元細胞;組合物中劑量組錐體細胞數量中度增加,胞質與細胞核較為清晰,細胞發生固縮現象較少;組合物高劑量組錐體細胞損傷狀態明顯減輕,錐體細胞數量明顯增多,胞質清晰,細胞核清晰可見,少見細胞發生固縮現象;人參皂苷Re組與燈盞花素組錐體細胞狀態改善作用較相對穩定,也可見減少大腦錐體神經元細胞固縮現象的發生。見圖1。

圖1 各組海馬組織細胞形態(HE染色,×400)

2.3各組海馬組織的細胞因子含量比較 模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均比假手術組顯著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。與模型組比較,組合物高劑量組和陽性藥組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著減少(P<0.05,P<0.01)。組合物低劑量組僅IL-1β含量顯著減少(P<0.05),IL-6、TNF-α含量無顯著差異(P>0.05)。組合物中劑量組IL-1β、TNF-α含量顯著減少(P<0.05),IL-6含量無顯著差異(P>0.05)。燈盞花素組與人參皂苷Re組各細胞因子含量有一定的減少趨勢但無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 人參皂苷Re、燈盞花素組合物對VD模型大鼠細胞因子的影響

3 討 論

VD是唯一可進行預防的癡呆類型,若早期對VD患者進行干預及治療,可有效延緩疾病發展。人參皂苷Re可顯著改善VD大鼠的認知能力,這可能與促進長時程增強的形成及抗膽堿能系統有關。現有研究證明,燈盞花素的抗炎、抗凋亡、抗血管內皮損傷〔7〕等作用可能是導致其發揮神經保護的作用機制。本研究結果顯示人參皂苷Re與燈盞花素組合物可改善VD大鼠的空間學習及記憶能力,而組合物高劑量組效果更為顯著。而單用人參皂苷或燈盞花素均對VD大鼠的空間學習記憶能力無明顯改善作用,這可提示兩者組合物具有協同增效作用。

海馬是與學習記憶、空間定位有關的重要部位〔8〕。因海馬對缺血、缺氧較為敏感,所以發生腦缺血時海馬區極易受損。因此,海馬組織的缺血可能形成了VD的病理基礎〔9〕。人參皂苷Re可以被血液吸收并迅速滲透到大腦中,它被認為是直接影響神經元的主要化合物〔10〕,可以顯著減少認知障礙小鼠神經元的損失〔11〕。燈盞花素可以降低腦損傷后腦組織含水量,改善海馬組織的病理損傷〔12〕。除此之外,燈盞花素可以抑制腦缺血模型大鼠的神經元和星形膠質細胞自噬,增強其神經保護作用〔13〕。本研究結果提示VD大鼠海馬區神經元的凋亡可致使其學習、記憶能力下降,而人參皂苷Re與燈盞花素組合物對缺血大腦有重要的保護作用,可以通過抑制海馬神經元的凋亡從而改善VD大鼠的認知功能障礙。

研究發現,在所有的VD動物模型中,TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的表達均顯著升高,這與臨床上 VD發病機制相吻合〔14〕。在腦缺血發生過程中,IL-6參與其炎癥反應。IL-1β可以對B淋巴細胞和T淋巴細胞的激活起到促進效果,而且還可以強化白細胞對內皮細胞的黏附,并可以調節TNF-α和IL-6的產生〔15〕。抑制TNF-α蛋白合成已被證明可以減輕受損神經元的損害,并緩解由神經炎癥引起的認知缺陷〔16〕。人參皂苷Re可以對小膠質細胞中IL-6、TNF-α、一氧化氮的產生進行抑制,而不會對細胞活性造成任何影響,通過減少小膠質細胞釋放的炎癥因子及神經毒性因子,來對海馬細胞起到保護作用〔17〕。燈盞花素可以顯著降低炎性細胞因子表達,降低了促凋亡蛋白表達,并抑制了NF-κB信號傳導和小膠質細胞的活化〔18〕。本研究結果提示,人參皂苷Re與燈盞花素組合物可有效抑制炎癥因子從而顯著降低海馬區炎癥反應。

綜上,VD是一個多環節、多因素、多途徑損傷的級聯反應所造成的認知功能障礙,而人參皂苷Re與燈盞花素組合物可有效改善VD大鼠的認知能力,降低VD大鼠海馬神經元的凋亡,抑制炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的生成,對VD模型大鼠發揮神經保護作用。