基于Keap1/Nrf2信號通路探討葛根芩連湯治療潰瘍性結腸炎小鼠腸黏膜損傷機制

張兆鵬 李秋英 于子晴 張茹 李婷 郭軍鵬 (長春中醫藥大學,吉林 長春 130117)

潰瘍性結腸炎(UC)是臨床上常見胃腸道炎癥性疾病之一,近些年其發病率呈逐年增加的趨勢〔1〕。目前除了傳統的皮質類固醇和氨基水楊酸治療外,臨床上新出現的一些治療藥物對于UC的治療效果仍然不是很理想〔2〕。而且,UC反復發作的特性使得很多藥物作用效果明顯降低,給患者造成嚴重的經濟負擔和精神壓力。葛根芩連湯(GGQL)由葛根、黃連、黃芩、炙甘草四味中藥組成,臨床常用于醫治與濕熱證相關的腹瀉患者〔3〕。但是,GGQL治療UC的具體作用機制還不清楚。本研究通過觀察疾病指數、結腸形態學、血清炎癥因子和氧化應激信號通路蛋白表達情況,探討GGQL對UC的治療作用及機制,為臨床應用GGQL治療UC提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 葡聚糖硫酸鈉(DSS)購自MP Biomedicals公司;葛根、黃連、黃芩、炙甘草購自長春中醫藥大學附屬醫院;柳氮磺吡啶腸溶片(SASP)購自上海福達制藥有限公司(批號:22200107);白細胞介素(IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α試劑盒購于北京華英生物試劑有限公司;抗體Kelch-樣ECH相關蛋白(Keap)1、核因子-E2相關因子(Nrf)2、ERK1/2、p-ERK1/2、β-肌動蛋白(actin)均購自Proteintech生物技術有限責任公司。

1.2藥品及制備 依據藥典及臨床用藥確定葛根芩蓮湯劑量:葛根15 g、黃連9 g、黃芩9 g、甘草6 g。根據人與小鼠體表面積換算用藥劑量。水煎煮2次,合并濾液,減壓濃縮,4 ℃保存備用。

1.3動物分組及給藥 50只雄性BALB/C小鼠,隨機分為正常(Normal)組、模型(Model)組、GGQL低(GGQL-L)、高(GGQL-H)劑量組、SASP組。2.5%DSS水溶液自由飲用連續7 d,制備病理模型。造模成功后,Normal組和Model 組給予生理鹽水,GGQL-L、GGQL-H組分別灌胃給予50、150 g/kg GGQL藥物濃縮液,SASP組每日灌胃給予SASP 200 mg/kg,連續7 d。

1.4疾病活動指數(DAI)評分 每天定時測量小鼠體質量,觀察大便性狀、血便狀態,并根據其狀態進行賦分:體質量下降0%,大便正常,無大便隱血,計0分;體質量下降1%～5%,大便松散,大便隱血陽性,計1分;體質量下降6%～10%,稀便,隱血強陽性,計2分;體質量下降11%～15%,稀水樣腹瀉,肉眼輕微血便,計3分;體質量下降≥16%,水樣腹瀉,肉眼血便,計4分。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血清中炎癥因子表達 取材前12 h禁食不禁水,取血清,按照試劑盒說明檢測血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.6結腸組織病理形態學檢測 取回腸末端至直腸遠端區域,測量其長度。取部分結腸制備病理切片,觀察形態學變化。

1.7Western印跡法檢測結腸組織相關蛋白表達 縱向打開結腸,用磷酸鹽緩沖液輕輕沖洗干凈,置于-80 ℃冷凍保存。Western印跡法檢測Keap1、Nrf2、ERK1/2、p-ERK1/2的表達情況。

1.8統計學方法 采用SPSS26.0和GraphPadPrism8.01 軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組體質量變化比率、DAI評分、結腸長度比較 與Normal組比較,Model組體質量變化比率顯著降低,DAI評分顯著升高,結腸長度顯著縮短(P<0.05)。與Model組比較,GGQL-L、GGQL-H、SASP組體質量變化比率顯著升高,DAI評分顯著降低,結腸長度顯著增長(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組結腸長度

表1 各組體質量變化比率、DAI評分、結腸長度、血清相關指標比較

2.2GGQL對UC小鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的影響 與Normal組比較,Model組IL-1β、TNF-α、IL-6顯著升高(P<0.05)。與Model組比較,GGQL-L、GGQL-H、SASP組IL-1β、TNF-α、IL-6顯著降低(P<0.05,P<0.01)。見表1。

2.3GGQL對UC小鼠結腸組織形態學的影響 Normal組結腸組織正常,細胞結構完整。Model組結腸組織水腫,單核細胞、淋巴細胞浸潤,有的形成淋巴濾泡,嚴重者黏膜脫落。GGQL-L組、GGQL-H組、SASP組結腸組織炎癥反應減輕,細胞結構完整。見圖2。

圖2 各組結腸組織形態(HE染色,大圖×10,小圖×40)

2.4GGQL對UC小鼠結腸組織Nrf2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響 與Normal組比較,Model組Keap1表達明顯升高,Nrf2、p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)。與Model組相比,GGQL-L組、GGQL-H組、SASP組Keap1表達明顯降低,Nrf2、p-ERK1/2表達顯著升高(P<0.05)。各組ERK1/2表達差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 GGQL對UC小鼠結腸組織NRF2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響

表2 GGQL對UC小鼠結腸組織Nrf2、Keap1、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白的影響

3 討 論

目前臨床上5-氨基水楊酸(ASA)是治療UC的常用藥物〔4,5〕。然而,5-ASA副作用明顯且復發率很高〔6〕。包括中草藥在內的補充和替代藥物最近在治療UC方面引起了廣泛的關注。中藥因其具有多靶點功能和多途徑作用機制等特點,臨床上利用中藥治療UC取得較好療效〔7〕。

葛根、黃芩、甘草中含有豐富的黃酮類化合物,其藥理作用主要有解熱、降壓、抑制血小板聚集、松弛胃腸平滑肌的作用,而且具有很強的抗炎、抗菌和抗病毒的療效。黃連中含有大量的小檗堿,具有抗潰瘍、抑制胃酸分泌、保護胃黏膜、抗炎鎮痛功效〔8〕。本實驗研究也表明GGQL能夠有效減輕UC小鼠結腸黏膜炎癥,降低DAI評分,明顯改善結腸黏膜形態學改變,改善腹瀉癥狀、恢復腸黏膜損傷。

IL-1β、IL-6、TNF-α是機體受到刺激后產生的致炎細胞因子,其主要作用是可促進炎細胞浸潤,加劇炎癥反應。Keap1/Nrf2是氧化應激信號通路關鍵分子。實驗結果顯示,GGQL能夠促進Nrf2入核,靶向抗氧化基因,通過抗氧化而發揮抗炎作用〔9〕,具有很強的抗炎特性〔10〕。絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路與UC的發生發展密切相關〔11〕。細胞外調節蛋白激酶(ERK)是MAPK信號通路系統重要成員,其活性形式p-ERK在炎癥反應過程中具有非常重要的地位〔12〕。本研究發現,ERK1/2分子參與了結腸黏膜抗氧化和抗炎作用。

綜上所述,GGQL能夠改善UC小鼠結腸黏膜損傷,其機制可能通過Keap1/Nrf2信號通路降低細胞炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平來改善DSS對結腸黏膜的炎癥反應。