SPON2基因表達與胃癌臨床病理學、預后的關系及其生物學功能

倪晨 梁素瑩 蔣健 王少開 陳志鵬 左云 (蘇州大學附屬張家港醫(yī)院,江蘇 蘇州 215600)

胃癌的發(fā)病率和病死率均較高,其男性發(fā)病率位于腫瘤發(fā)病率第2,病死率居于第3,女性發(fā)病率位于腫瘤發(fā)病率第5,病死率居于第2〔1～3〕。胃癌對人們的生命安全造成了較大的威脅〔3〕。因此,對胃癌疾病的發(fā)病機制進行深入研究,對胃癌發(fā)病相關的關鍵基因進行篩選和鑒定并且其對早期胃癌診斷及治療的靶標能力進行評價具有相對重要的臨床意義和理論價值〔4〕。脊椎蛋白(SPON)2作為一種細胞外基質(zhì)分泌蛋白,在患者的先天性免疫和獲得性免疫中發(fā)揮著重要作用,其能夠促進神經(jīng)元的生長并且募集炎性細胞〔5〕。研究發(fā)現(xiàn),肺腺癌、結(jié)直腸癌及肝癌患者的預后與SPON2表達存在相關性〔6〕。但是SPON2在胃癌組織的表達和功能對胃癌患者的預后還未見報道。本研究探討SPON2基因表達與胃癌臨床病理學、預后的關系及其生物學功能。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年1月至2018年4月到蘇州大學附屬張家港醫(yī)院就診的108例胃癌手術治療患者,平均年齡(63.28±6.48)歲,所有患者及家屬知曉此項研究并簽署知情同意書。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批。患者進行胃癌根治性切除術,患者癌旁組織選擇距離癌組織邊緣3 cm 以內(nèi)的區(qū)域,收集患者的1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm大小的新鮮腫瘤組織及癌旁正常組織,儲存在1.5 ml EP管中,儲存在-80 ℃冰箱中待用。另外,大體組織用多聚甲醛固定,脫水,石蠟包埋后進行病理組織切片分析。應用SPON2 mRNA的中位值將患者分為高、低表達組進行為期36個月的隨訪分析患者生存情況。

1.2細胞及材料 人胃癌細胞株MGC-803由中國科學院上海細胞庫。0.25%胰蛋白酶、胎牛血清及RPMI1640培養(yǎng)基由蘇州有實醫(yī)療器械有限公司。熒光定量試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京天根生化科技有限公司,β-actin抗體、SPON2抗體購自Abcam,電化學發(fā)光(ECL)試劑盒、Marker、蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液由碧云天生物公司提供,垂直電泳儀、熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)儀、逆轉(zhuǎn)錄儀由Bio-Rad提供,凋亡檢測試劑由北京貝博生物公司。

1.3免疫組化 對石蠟標本進行切片,將組織脫蠟水化,進行抗原修復,內(nèi)源性酶去除,對抗原進行封閉,加入SPON2一抗和二抗進行孵育,然后發(fā)色,然后進行蘇木素負染,脫水、封片和鏡檢。隨機選擇5個視野,染色為棕褐色或棕黃色為SPON2陽性表達。

1.4Western印跡與細胞總蛋白提取 將組織進行勻漿并對細胞進行裂解,對蛋白濃度進行定量后,應用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行分離,將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜,應用SPON2一抗進行封膜過夜,應用二抗進行洗膜,加入顯影液,應用凝膠成像系統(tǒng)對條帶進行顯影。

1.5實時熒光定量(qRT)-PCR和細胞轉(zhuǎn)染 使用RNA干擾慢病毒構建SPON2低表達穩(wěn)轉(zhuǎn)株(慢病毒序列:5'-CCGACTACAGCATGTGGAGGAAG-3'),慢病毒購自吉凱公司。應用Trizol方法對細胞總RNA進行提取,進行逆轉(zhuǎn)錄后,進行qPCR擴增實驗,對SPON2表達進行計算,GAPDH為內(nèi)參。

1.6增殖實驗 應用shRNA構建SPON2低表達胃癌細胞,分為空白對照(Mock)組、陰性對照(sh-NC)組、sh-SPON組。將SPON2低表達細胞株和Mock組細胞用胰酶進行消化,將1×104個細胞接種到96孔板中,培養(yǎng)孵育72 h后,每孔加入10 μl的CCK-8溶液,孵育1 h后,應用酶標儀檢測各孔450 nm下的吸光度。吸光度代表細胞增殖情況。用胰酶消化SPON2低表達細胞和Mock組細胞,將其接種到6孔板中,500個細胞每孔,培養(yǎng)14 d后,用多聚甲醛固定,結(jié)晶紫染色顯微鏡觀察克隆形成。

1.7劃痕實驗 SPON2低表達細胞株和Mock組細胞接種1 d后,應用槍頭在培養(yǎng)液中劃一道均勻劃痕,應用磷酸鹽緩沖液(PBS)將脫落細胞進行清洗,然后加入2 ml無血清培養(yǎng)基,分別與0 h和培養(yǎng)24 h后進行拍照觀察劃痕寬度。

1.8細胞侵襲實驗 將細胞進行消化,應用RPMI1640培養(yǎng)基進行重懸,每孔加入50 μl基質(zhì)膠鋪于Transwell膜小室中,然后孵育30 min,將200 μl細胞懸液加入小室上室,下室中加入500 μl的血清培養(yǎng)基,培養(yǎng)36 h后,應用PBS進行清洗,應用多聚甲醛進行固定,風干后,用結(jié)晶紫進行15 min染色,應用PBS進行清洗,隨機選取5個視野取平均值。

1.9統(tǒng)計學分析 采用SPSS19.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗及Z檢驗。

2 結(jié) 果

2.1組織中SPON2表達 胃癌組織中SPON2蛋白及mRNA表達較癌旁正常組織明顯升高(P<0.05)。見表1。免疫組化結(jié)果顯示,SPON2染色主要分布于細胞質(zhì),胃癌組織染色陽性表達較高。見圖1。Western印跡結(jié)果顯示,癌癥組織中SPON2蛋白表達(3.85±0.26)明顯高于癌旁正常組織(1.81±0.15,P<0.05)。見圖2。

圖1 SPON2免疫組化染色(×200)

T:胃癌組織;N:癌旁正常組織圖2 8例癌旁正常組織和胃癌組織中SPON2蛋白表達

表1 各組織SPON2蛋白及mRNA相對表達量(n=108)

2.2胃癌患者臨床資料與SPON2表達關系 胃癌患者組織壞死、性別和年齡與SPON2 mRNA表達水平及SPON2蛋白表達無明顯相關性(P>0.05);患者的遠端轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和腫瘤直徑與胃癌組織SPON2蛋白和mRNA表達有相關性(P<0.05)。見表2。

表2 胃癌患者臨床資料與SPON2表達關系

2.3SPON2表達與胃癌患者的預后關系 Kaplan-Meier單因素生存分析結(jié)果顯示,SPON2高表達組的生存率〔37.04%(20/54)〕明顯低于低表達組〔68.52%(37/54)〕(P<0.05);兩組生存曲線差異也有統(tǒng)計學意義(P<0.05),SPON2高表達組半數(shù)生存期為24個月,SPON2低表達組半數(shù)生存期>36個月。見圖3。

圖3 SPON2高表達組和SPON2低表達組生存曲線

2.4細胞遷移和侵襲 CCK-8細胞增殖實驗顯示,敲除SPON2后胃癌細胞增殖能力減弱,shRNA-SPON2組OD值明顯低于sh-NC組(P<0.05)。克隆形成實驗顯示,14 d后shRNA-SPON2組細胞克隆數(shù)明顯低于sh-NC組(P<0.05)。劃痕實驗證實,shRNA-SPON2組細胞的劃痕面積占比明顯高于sh-NC組(P<0.05)。細胞侵襲實驗表明,shRNA-SPON2組細胞的侵襲數(shù)明顯低于sh-NC組(P<0.05)。見圖4、圖5、表3。Mock組為未經(jīng)處理的MGC-803細胞。

圖4 各組克隆形成實驗(結(jié)晶紫染色)

圖5 各組遷移、侵襲實驗(結(jié)晶紫染色,×200)

表3 各組細胞遷移和侵襲

3 討 論

無論是國內(nèi)還是全世界范圍內(nèi),胃癌的發(fā)病率和病死率都位于前列〔7,8〕。伴隨著胃鏡等內(nèi)鏡技術的發(fā)展及胃癌流行病學的深入研究和臨床治療技術的發(fā)展,對胃癌進行早期診斷的概率大大提升,患者的預后水平也有著較大的提升〔9,10〕。但是胃癌早期階段的基本臨床癥狀與慢性胃炎的癥狀有著一定相似度,而且大多數(shù)患者鑒別能力和健康意識較差〔11,12〕,現(xiàn)在臨床診斷篩查靶標存在一定的局限性,導致大部分胃癌患者在確診時已經(jīng)發(fā)展為遠處轉(zhuǎn)移或者伴有淋巴結(jié)浸潤的中晚期,對患者的預后及臨床治療療效產(chǎn)生了較大限制〔13,14〕。所以不但要推廣和建立早期篩查意識,還需要尋找一種能夠有效早期診斷胃癌的標志物,且其應具有更好地臨床應用價值和理論意義〔15,16〕。

SPON2屬于一種細胞外基質(zhì)蛋白,其能夠?qū)逃忻庖邞疬M行激活并且對炎癥細胞進行募集〔17,18〕。研究發(fā)現(xiàn),SPON2在多種腫瘤組織中均存在較高表達,如乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌和肝癌〔19～21〕。本研究結(jié)果提示,胃癌的發(fā)生與SPON2高表達有一定相關性。本研究表明,SPON2表達與患者的預后存在相關性,SPON2高表達提示胃癌患者的預后不佳。

本研究對胃癌細胞的SPON2基因進行敲除,胃癌細胞的增殖被抑制了,這與其他腫瘤細胞SPON2敲除后結(jié)果相同〔22,23〕。本研究結(jié)果表明,SPON2高表達能夠促進胃癌的遠處轉(zhuǎn)移。然而,先前有研究發(fā)現(xiàn),SPON2過表達組肝癌細胞的侵襲能力和遷移能力受到抑制。所以,SPON2對不同腫瘤細胞的遷移和侵襲的作用是復雜的,需要進行深入的研究〔24,25〕。

綜上,SPON2在胃癌患者腫瘤組織中表達相對較高,SPON2表達水平與胃癌患者的腫瘤轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和腫瘤直徑相關,而且SPON2表達水平對患者的預后有著指導作用,腫瘤組織中SPON2水平越高,患者的預后越差。對胃癌細胞SPON2進行敲除,能夠抑制胃癌細胞的遷移和侵襲能力。本研究也存在一定的缺陷,為回顧性研究,納入患者的數(shù)量較少,還有待大樣本數(shù)據(jù)驗證,SPON2在胃癌細胞中的具體作用機制還有待研究。