富血小板血漿通過抑制P53/Caspase-3途徑改善脂多糖誘導的BV2細胞凋亡

王應輝 張婭 朱紫馨 牟秋菊 祝麗麗

(1貴州醫科大學附屬醫院輸血科,貴州 貴陽 550004;2貴州省黔南州人民醫院醫學檢驗科)

富血小板血漿(PRP)是通過從全血富集而來富含血小板的血漿成分,在外科手術中如難愈合的創口修復、皮膚修復、美容修復等已被運用于臨床〔1,2〕。然而PRP在中樞神經細胞凋亡抑制作用與分子機制方面尚未闡明。細胞凋亡廣泛存在于各種病理或生理環境中,老年神經退行性疾病如帕金森病(PD)和阿爾茨海默病(AD)等的發生正是由于神經細胞長期處在持續慢性炎癥反應中導致的細胞毒性反應〔3,4〕,這類疾病目前尚未有良好的治療方法,因此探索能抑制神經細胞凋亡的新藥物對神經退行性疾病的治療具有重要意義。研究發現,當神經系統損傷時,小膠質細胞被激活從而促進炎癥細胞因子和趨化因子的表達〔5〕,進一步誘導神經炎癥反應和細胞凋亡,最后導致神經細胞死亡〔6,7〕。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)是參與細胞凋亡的重要信號通路,AKT活化調控下游信號分子P53等促進細胞凋亡水平〔8,9〕。此外,小膠質細胞釋放的炎癥因子可促進細胞線粒體介導的細胞凋亡〔10,11〕。因此,通過抑制凋亡來改善或逆轉其病理過程可能是治療神經系統炎癥反應的有效策略。脂多糖(LPS)是能誘導炎癥反應的革蘭陰性菌內毒素成分,而BV2細胞有似于原代小膠質細胞的總體反應模式,經常被用來構建體外細胞模型進而研究神經元損傷的分子機制〔12,13〕。本研究以LPS誘導的BV2細胞模型為對象,旨在探討PRP通過P53/胱天蛋白酶(Caspase)-3途徑抑制神經凋亡的分子機制,為神經退行性疾病的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑 DMEM/F12高糖培養基(C11330500BT)購自美國Gibco公司;LPS(L-6529)購自美國Sigma公司;胎牛血清(04-001-1ACS)、磷酸鹽緩沖液(PBS,02-024-1ACS)購自以色列Biological Industries;TUNEL試劑盒(E-CK-A320)購自武漢Elabscience公司。相關抗體:抗P53(ab26)、抗AKT(ab8805)、抗p-PI3K(ab182651)購自ABCAM;抗Caspase-3(19677-1-AP)、抗p-AKT(66444-1-Ig)、抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax,60267-1-Ig)、抗Bcl-2(26593-1-AP)、抗Caspase-9(66169-1-Ig)購自武漢山鷹生物;單克隆內參抗體磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH,AB-P-R001)購買于杭州賢至,辣根過氧化酶(HRP)標記二抗(PKM-014-090S)購自武漢普美克。

1.2主要儀器 高速離心機(德國 Eppendorf 公司),超純水儀(英國 ELGA Classic UF 公司),一體式化學發光成像系統 (中國上海 Clinx ChemiScope有限公司),濕轉電泳槽、電泳儀(美國伯樂公司),倒置熒光顯微鏡 (日本Olympus公司),激光共聚焦顯微鏡 (重慶君瀾醫療器械有限公司)。

1.3PRP的制備 SD大鼠(3～4月齡雄性,SPF級,180～230 g),從貴州醫科大學實驗動物中心購買,正常飼料喂養,正常飲水,不做任何刺激。麻醉后心臟采血,通過二次離心法〔14〕(800 r/min,離心10 min;2 000 r/min,離心12 min)分離PRP,與凝血酶體積比為9∶1混勻激活后,12 000 r/min離心15 min取上清備用。將BV2小膠質細胞分成正常組(不做干預),10%PRP組(加入10%濃度PRP),LPS組(1 μg/ml LPS激活)和不同濃度PRP(3%、5%和10%)+LPS組(1 μg/ml LPS激活后加入不同濃度PRP)。

1.4BV2細胞的形態學變化 將BV2細胞(5×105細胞/孔)接種于6孔板中,用不同濃度PRP預處理1 h,然后用LPS(1 μg/ml)〔15〕刺激4 h,用PBS洗滌兩次10 min后,在光鏡下觀察BV2細胞形態改變。

1.5BV2細胞凋亡測定 用不同濃度PRP預處理BV2細胞1 h,再用LPS(1 μg/ml)刺激24 h,收集細胞進行涂片,按TUNEL說明書用4%多聚甲醛將細胞固定、PBS清洗和0.2% Triton-100通透與洗滌,TUNEL染色和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染,使用激發波長為450～500 nm的熒光顯微鏡觀察。

1.6Western印跡分析 將BV2細胞5×105細胞/ml密度種到6孔板中,在LPS(1 μg/ml)刺激之前,用不同濃度PRP預處理1 h,共培養24 h后用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖裂解液在冰上處理45 min,并在4 ℃下以12 000 r/min離心20 min。 通過二喹啉甲酸(BCA)蛋測定蛋白質濃度。 在分離膠為12%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上分離出等量的蛋白質(40 μg),并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。 然后將膜與5%脫脂牛奶在室溫環境下封閉1 h。 4 ℃過夜用特異性的一抗(1∶1 000)孵育,洗滌3遍后,將印跡膜與HRP耦聯的二抗(1∶10 000)在室溫下孵育1.5 h。 Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)洗滌3遍后,用增強的化學發光試劑盒(Thermo)檢測膜相關蛋白的表達。

1.7統計學分析 采用GraphPad Prism8.0.1軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1各組PRP對BV2細胞形態改變的影響 與正常組比較,10%PRP組細胞形態處于非活化狀態,胞體較小,呈菱形,且具有細長的突起;與正常組及10%PRP組比較,LPS組活化率顯著增高(P<0.01),胞體增大,突起消失或回縮變短,呈圓形或橢圓形,形態類似阿米巴樣(圖1箭頭處)。與LPS組比較,不同濃度PRP(3%、5%、10%)預處理BV2細胞后,活化的細胞數量明顯減少(P<0.01)。見圖1、表1。

表1 各組BV2細胞活化率、TUNEL陽性細胞數比較

圖1 各組BV2細胞形態(DAPI,×200)

2.2各組PRP對BV2細胞凋亡的影響 與正常組比較,10%PRP組TUNEL染色無明顯變化,而LPS組TUNEL陽性細胞數明顯增加(P<0.01)。與LPS組比較,不同濃度PRP(3%、5%、10%)預處理后,BV2細胞凋亡水平明顯降低(P<0.01)。見表1、圖2。因10%PRP干預后BV2活化細胞數量和細胞凋亡水平改善最為顯著(P<0.01),故后續使用10%PRP濃度進行研究。

圖2 TUNEL檢測各組BV2細胞凋亡(×400)

2.3各組細胞p-PI3K、p-AKT和P53表達比較 與正常組比較,10%PRP組p-PI3K和p-AKT蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與正常組及10%PRP組比較,LPS組p-PI3K和p-AKT表達明顯減低,而P53表達明顯增加(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組p-PI3K和p-AKT表達均顯著增加,P53表達顯著下調(P<0.01)。見表2、圖3。

表2 各組BV2細胞線粒體凋亡相關蛋白、p-PI3K、p-AKT、P53及LCⅡ表達

1～4:正常組、10%PRP組、LPS組、10%PRP+LPS組;下圖同圖3 各組BV2細胞p-PI3K、p-AKT和P53表達

2.4各組細胞自噬相關蛋白微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)Ⅱ表達比較 與正常組比較,LPS組及10%PRP+LPS組LC3Ⅱ蛋白表達明顯增加(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組LC3Ⅱ蛋白表達明顯降低(P<0.01)。見表2、圖4。

圖4 各組BV2細胞LC3Ⅱ蛋白表達

2.5各組細胞線粒體凋亡相關蛋白表達比較 與正常組比較,10%PRP組Bcl-2表達顯著增加(P<0.01),Bax、Cleaved-Caspese9、Cleaved-Caspese3蛋白表達差異均無統計學意義(P>0.05)。與正常組及10% PRP組比較,LPS組Bax、cleaved-Caspese9、cleaved-Caspese3蛋白表達明顯增加(P<0.01),Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.01)。與 LPS組比較,10%PRP+LPS組Bax、Cleaved-Caspese-9、Cleaved-Caspese-3蛋白表達明顯降低,而Bcl-2蛋白表達明顯上調(P<0.01)。見表2、圖5。

圖5 各組BV2細胞線粒體凋亡相關蛋白表達

3 討 論

PRP是富含血小板的血漿成分〔16〕。PRP中的血小板一旦被激活,α顆粒將會釋放血小板衍生生長因子(PDGF)、胰島素樣生長因子(IGF)-Ⅰ和轉化生長因子(TGF)-β等多種生長因子〔17〕,這些豐富的生長因子可以為損傷的細胞提供修復和營養支持功能,從而減少神經細胞的損傷和凋亡〔18,19〕。此外,小膠質細胞的過度激活可分泌過量的炎性介質(如腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-6、環氧合酶-2等),產生免疫反應和神經炎癥,最后導致神經細胞發生凋亡〔20,21〕。因此,通過抑制小膠質細胞的過度激活進而降低免疫介質的產生和減少細胞病理性凋亡是研究抗神經炎的核心問題。

本研究結果提示,細胞已被激活形成了炎癥模型,但多數細胞形態改變不明顯,這可能是細胞與LPS干預時間或敏感性有關且本研究還提示PRP可以減輕LPS誘導的BV2細胞凋亡水平。以上結果顯示,10%PRP+LPS在降低BV2細胞形態的改變和DNA片段的生成效果最顯著,因此本研究使用此濃度進行探索其可能的抗凋亡機制。

PI3K/AKT介導的信號傳導是調節細胞存活、增殖、分化和凋亡最關鍵的途徑之一〔22〕。生長因子等條件觸發PI3K分子磷酸化,進而協調細胞的生長和細胞存活〔23〕。P53表達上調可抑制Bcl2表達,從而促進細胞凋亡〔24〕。本研究提示,PRP可降低LPS誘導的BV2細胞炎癥反應所致的細胞凋亡,可能是通過激活PI3K/AKT信號通路從而降低P53表達實現的。

線粒體是參與細胞凋亡的重要調控者。當受病理或生理信號刺激后,Bcl-2和Bax表達失衡,致使線粒體功能改變,凋亡誘導因子被釋放到線粒體外,激活下游Caspase級聯反應,最終導致細胞凋亡〔25,26〕。本研究結果提示,PRP能降低LPS誘導BV2細胞炎癥反應誘導的細胞凋亡,其機制可能與PRP降低線粒體介導的細胞凋亡有關。此外,本文發現PRP能降低自噬標志物LC3Ⅱ的活化水平,但其機制需要進一步探索。