基于JAK/STAT-3通路探究右美托咪定對神經痛大鼠鎮痛及星形膠質細胞活性的作用機制

周啟 雷華娟 寧彧 張慧芳

(1湖南中醫藥大學第一附屬醫院麻醉科,湖南 長沙 410007;2長沙市第三醫院麻醉科)

神經性病理疼痛是由于機體疾病或損傷時影響了軀體感覺神經系統而導致的疼痛表現,可分為周圍性疼痛、炎癥性疼痛和中樞性疼痛等不同類型。神經性疼痛與其他疼痛有所不同,在排除相關誘因后仍能夠長期存在,具有頑固性、難治愈性等特點,且目前尚無有效的治療方法,是現階段醫學研究中需重點解決的問題之一〔1〕。右美托咪定(Dex)作為臨床中的常見的醫用麻醉藥物,是一種高選擇性的α-2腎上腺素受體激動劑,對急性炎癥疼痛、術后疼痛、阿片類藥物不敏感的神經病理性疼痛等有較好的緩解作用〔2〕。也因其對中樞與周圍神經系統具有較好的鎮靜、鎮痛、抗焦慮作用而被廣泛應用于臨床治療當中。于鞘內注射Dex可抑制去甲腎上腺素的生成和分泌,進而緩解相關病理性疼痛,現階段主要用于手術中的麻醉輔助及重癥患者鎮痛〔3〕。星形膠質細胞在神經病理性痛的發生和維持中起重要作用,且當坐骨神經等受到壓迫性損傷時可導致損傷側脊髓背角星形膠質細胞的增殖活化,進而增加疾病的疼痛并影響治療效果〔4〕。Janus激酶/信號轉導與轉錄激活子(JAK/STAT)信號通路可將細胞外信號傳遞至細胞核內進行轉錄,并通過由細胞因子激活的信號轉導通路參與細胞增殖、分化,不僅表現在記憶形成、神經退行性變、突觸可塑性等方面,還可參與神經病理性疼痛的形成過程〔5〕。本文主要通過基于JAK/STAT-3探究Dex對神經痛大鼠鎮痛及星形膠質細胞活性的作用機制,意在為日后臨床中神經疼痛的治療提供有力依據。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 選取SD雌雄各半大鼠40只,體質量150～250 g,由湖南中醫藥大學動物學部提供,使用許可證號:SCXK(湘)2019-0075。室溫25 ℃飼養,濕度約為50%,正常光照,喂養條件為標準飼料和自來水自由攝取,所有操作嚴格按照實驗動物倫理委員會動物管理與使用指南執行。

1.2藥物、試劑與儀器 0.9%生理鹽水(重慶天圣制藥有限公司),Dex(揚子江藥業集團有限公司),氯胺酮(陜西健民制藥有限公司),多聚甲醛、生理鹽水(武漢博士德公司),PCR試劑盒(伊萊瑞特生物科技有限公司),JAK2、STAT3抗體(萊比信生物技術公司),von Frey纖維絲、石蠟切片機(上海醫用儀器廠),包埋儀(長沙益廣制藥機械公司),外科手術器械(江蘇拜爾斯醫療科技有限公司),熱痛刺激儀(中國醫學科學院)。

1.3模型制作 采用50 mg/kg氯胺酮對大鼠進行腹腔內注射麻醉,待麻醉完全后將大鼠俯臥固定,剔除左后肢毛發,備皮、消毒,于無菌環境下采用克氏針觸及大鼠坐骨結節部位,在大鼠股骨外側0.5 cm處進行切口,分離二頭肌與半腱肌等肌肉組織,暴露股段高位右側坐骨神經,用小止血鉗夾住神經背側,勿將神經擠壓在其下的組織上,用3-0硅制絲線間隔1 mm縫入神經干內結扎神經背側1/3和1/2處,以左后肢輕度顫動為最佳結扎強度,完成后依次用絲線縫合皮膚,為建模成功。

1.4分組與給藥 將40只大鼠隨機分為4組,每組10只,分別為正常組、模型組、Dex組、Ket組,除正常組外,其余大鼠均建立坐骨神經結扎病理性疼痛模型,建模成功后,Dex組采用0.2 ml/kg右美托咪定進行大鼠坐骨神經周圍注射,Ket組采用10 mg/kg氯胺酮進行腹腔注射,模型組與正常組采用10 ml/kg的生理鹽水進行注射,均每天一次,連續干預30 d。

1.5各組疼痛行為機械性縮足反射閾值(MWT)、熱縮腿潛伏期(TWL)檢測 MWT測定:將大鼠放于1.0 cm×1.0 cm的金屬網格內將玻璃罩蓋好靜置30 min后,采用不同力度的纖維絲對大鼠的右后爪足底部進行5次/min刺激,刺激力度由小到大,若刺激部位出現抬腿、縮足等反應視為有效,將大于3次的最低力度記為反應閾值。TWL測定:將大鼠放于玻璃箱中適應30 min后,對大鼠后爪底部行照射刺激,計時為每次大鼠表現出快速縮足、回避或抬腿等反應時暫停刺激,將基礎強度設為10 s,自動斷開時間為20 s,每5 min測定1次,共測定3次取平均值。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色 大鼠處死后剔除腰背脊髓組織表面肌肉進行坐骨神經組織提取,浸泡于3%多聚甲醛溶液中固定,將石蠟切片置于60 ℃的保溫箱中1 h,再經二甲苯及60%～100%不同濃度的酒精反復脫蠟至水3次后用蒸餾水清洗,置入蘇木素中染色15 min,將浮色沖洗,行1%鹽酸酒精分色數秒,待切片褪色適中后用蒸餾水漂洗15 min,伊紅酒精中復染后撈出切片放置于蒸餾水下,用90%和100%乙醇脫水2次1 min/次,侵入二甲苯溶液中15 min透明,樹膠封固,于顯微鏡下觀察病理組織。

1.7TUNEL檢測脊髓背角星形膠質細胞凋亡 將坐骨神經組織脫蠟及水化后0.7%鹽水及磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次5 min/次,根據TUNEL檢測說明書取TUNEL反應液,恒溫下孵育2 h,將玻片置于PBS中在沖洗5 min×3次,將切片浸入濃度為3%過氧化氫中5 min后用PBS脫色,進行酶標反應后再用PBS浸洗10 min,將切片置于二氨基聯苯胺(DAB)混合液,出現淺棕色背景時采用去離子水反復沖洗3次,5 min后蘇木素進行復染,用濃度為1%的酒精分化,氨水反藍后沖洗,將坐骨神經切片依次放入濃度為70%、80%酒精和無水乙醇梯度脫水15 min,在二甲苯中脫水透明5 min進行樹膠封片,于高倍鏡下拍攝細胞凋亡情況。

1.8Western印跡檢測坐骨神經中JAK2、STAT3蛋白表達 取已處死大鼠的脊髓背角,加入0.15%胰蛋白裂解液,離心機運轉15 000 r/min離心30 min后取上清液,用7%十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙酰胺凝膠分離蛋白,血清樣品中加入樣孔進行電泳,聚偏氟乙烯(PVDF)膜緩沖鹽溶液浸泡15 min后PBS反復沖洗,5 min/次,分別加入JAK2(1∶500)、STAT3(1∶1 000)、β-actin抗體(1∶1 000),辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG作為二抗(1∶2 000),分別雜交后進行PBS沖洗,以β-actin為內參指標,采用顯色劑進行顯色和灰度掃描分析掃描條帶,計算JAK2、STAT3蛋白表達量。

1.9PCR檢測坐骨神經中JAK2、STAT3 mRNA表達 取大鼠的脊髓背角組織,用Trizol提取總RNA后,核酸定量儀檢測提取RNA的濃度和純度,按照第一鏈合成系統說明書進行逆轉錄制備cDNA,以β-actin為內參進行熒光定量PCR擴增檢測各組JAK2、STAT3 mRNA的表達水平,60 ℃預處理3 min,循環1次,80 ℃預變性15 min,循環1次,95 ℃變性15 s,50 ℃退火30 s,70 ℃延伸30 s,循環30次,每組設置3個復孔,用2%瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察并拍照和圖像分析,PCR產物量以光密度×面積表示,根據2-ΔΔCt值計算相對表達,引物序列:JAK2正向:5′-AAGTGCGTGCGAGCGAAGA-TC-3′,反向:5′-TGCTGAATGAACCTGCGGAATCTG-3′;STAT3正向:5′-CCAGTCGTGGTGATCTCCAACATC-3′,反向:5′-CGCTTGGTGGTGGACGAGAAC-3′;β-actin正向:5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′,反向:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTAC-3′。

1.10星形膠質細胞培養 打開大鼠皮膚和脊髓組織收集組織,在PBS中清洗組織一次,將組織置于無血清DMEM/F12培養基中,將組織分割成小塊組織轉移至干凈離心管中,加入0.12%胰蛋白酶,在37 ℃恒溫水浴中消化組織15 min,加入血清溶液停止胰蛋白酶化,沉淀后收集上清液,將剩余組織勻漿經胰蛋白酶消化,將組織溶解液固定,過濾后的溶液以2 000 r/min離心10 min取出上清液,將細胞重新懸浮在完整的培養基中進行細胞計數,每2 d更換一次細胞培養基,10 d后觀察分層細胞層,下層細胞是星形膠質細胞,將覆蓋著膠質細胞的培養瓶放置于振蕩器上,以200 r/min的速度混合15 min,收集培養基并用PBS清洗非黏附細胞,將細胞以1 500 r/min離心5 min,用完整的培養基重新懸浮細胞顆粒,去除上清液在37 ℃下用5%的CO2培養15 min,更換培養基后,將培養瓶中的黏附細胞純化為所需膠質細胞。

1.11MTT檢測星形膠質細胞增殖 取星形膠質細胞以0.25%胰酶消化并計數,接種于96孔板中培養,使每孔細胞密度為1×106個,每組設5個平行孔并設不含細胞的空白對照,37 ℃培養過夜使細胞貼壁,加入Dex 0.2 ml/L(Dex組)、AG490 10 μmol/L(JAK2抑制劑組)、WP1066 5 μmol/L(STAT3抑制劑組),分別培養24、48、72 h后,棄去原培養液,每孔加入MTT 5 mg/ml試劑繼續培養3 h,在500 nm波長下檢測OD值,細胞抑制率=(1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.12統計學方法 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組疼痛行為比較 與正常組比較,模型組MWT、TWL表達顯著降低(P<0.05),與模型組比較,Dex組MWT、TWL表達顯著升高(P<0.05),與Dex組比較,Ket組MWT、TWL表達顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組疼痛行為、星形膠質細胞凋亡率、坐骨神經中JAK2、STAT3蛋白及mRNA比較

2.2HE染色 正常組坐骨神經的神經纖維結構完整且均勻分布,排列整齊有序,外模和形態完整,髓鞘緊密圍繞軸突結構明確;模型組出現髓鞘腫脹的現象,有部分神經鞘膜水中及軸突現象產生導致排列密集紊亂;Dex組神經纖維結構不清晰現象有所緩解,軸突逐漸清晰,水腫現象好轉,外膜形態有所顯現;Ket組仍有排列紊亂,髓鞘和軸突結構不清晰現象。見圖1。

圖1 各組坐骨神經組織(HE染色,×200)

2.3各組脊髓背角星形膠質細胞凋亡比較 與模型組比較,Dex組星形膠質細胞凋亡率顯著升高(P<0.05),與Dex組比較,Ket組星形膠質細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組星形膠質細胞凋亡(TUNEL染色,×200)

2.4各組坐骨神經中JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達比較 與正常組比較,模型組坐骨神經中JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.05),與模型組比較,Dex組JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著降低(P<0.05),與Dex組比較,Ket組JAK2、STAT3蛋白及mRNA表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組JAK2、STAT3蛋白表達

2.5各組星形膠質細胞增殖率比較 干預24、48及72 h時,JAK2抑制劑組、STAT3抑制劑組星形膠質細胞增殖率均顯著高于Dex組(P<0.05),JAK2抑制劑組與STAT3抑制劑組比較無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組星形膠質細胞增殖率比較

3 討 論

以往研究認為,疼痛是機體組織在一定程度上受損或由于存在潛在性損傷而造成的,可在一定程度上衡量患者的健康水平。隨著對疼痛研究的逐漸深入,有學者認為,疼痛不僅是神經功能紊亂的一種表現也是疾病的一種〔6〕。在疼痛發生的初始階段,會有脊髓星形膠質細胞異常現象的產生,而隨著損傷的逐漸恢復,細胞的異常狀況也隨之改善。在病理性神經疼痛的治療中,常用的藥物主要為抗癲癇類、三環類及去甲狀腺素再攝取等抑制類藥物〔7〕。而右美托咪定作為一種新型、高選擇性的腎上腺受體激動劑,在臨床中具有鎮靜、止痛及抑制交感神經興奮等效果,其作用時間長且能在患者的手術期維持相對穩定狀態〔8〕。

MWT和TWL作為反映疼痛程度的重要指標,在探究神經病理疼痛和反映神經刺激及骨外周神經激活等方面具有一定意義〔9〕。本研究結果表明,Dex可發揮改善神經痛大鼠的作用進而影響MWT、TWL的表達。相關研究表示,Dex在神經疼痛中可能通過激動突觸前膜受體,抑制去甲腎上腺素等血漿兒茶酚胺及興奮性神經遞質和谷氨酸鹽的釋放,進而終止疼痛信號的傳導〔10〕。周斌等〔11,12〕研究表示,Dex通過增強神經元興奮,使機體內環境中環磷酸腺苷(cAMP)濃度升高,在抑制介導疼痛的電流中發揮鎮痛作用。Dex并通過麻醉作用減輕神經根周圍炎性引起的痛覺反應,使受體激動劑介導作用增強,并增加根神經活動空間和加大內源性物質的釋放,進而降低機體對疼痛刺激的敏感性和改善疼痛反應。

本研究結果表明,Dex對促進坐骨神經疼痛大鼠星形膠質細胞凋亡具有一定相關性。相關研究表示,正常生理條件下,星形膠質細胞可幫助神經元與環境間進行物質交換,利于為神經元提供營養物質和保持周圍環境的穩定,并可通過相互作用形成復合體樣結構,起到維持正常機體微環境的作用〔13,14〕。而疾病中活化的星形膠質細胞參與了多種神經系統疾病的損傷過程,如阿爾茨海默病、帕金森病和肌萎縮側索硬化癥等,且活化星形膠質細胞的毒性作用高于其支持組織修復的作用〔15〕。研究表明,Dex對神經的保護作用可能與下調內質網應激特異性蛋白及上調內質網應激激活細胞凋亡水平有關,并通過麻醉作用降低神經損傷發生率,促進神經組織中星形膠質細胞的凋亡,進而抑制其在疾病中的細胞活性及坐骨神經的毒性反應,起到改善神經疼痛的作用〔16,17〕。

JAK/STAT信號通路是細胞因子信號轉導的重要途徑,可參與機體的免疫調節、細胞活性及疾病發展,神經痛發生時可使磷酸化的JAK2、STAT3信號通路被激活進而參與疾病的進程〔18〕。本研究結果表明,Dex對抑制疾病中JAK2、STAT3表達具有一定積極影響。相關研究表示,STAT通過與酪氨酸相關受體結合與酪氨酸殘基反應,并通過吸引STAT結合到受體上,使磷酸化的JAK2、STAT3轉位到細胞核內,調控相關疼痛因子轉錄從而參與神經疼痛病疾病發展過程〔19〕。Pan等〔20〕研究表示,Dex能夠緩解神經性疼痛可能與其抑制相關蛋白酶的表達具有一定相關性,并可能在多途徑調節細胞因子的釋放和通過介導JAK2、STAT3使下游的蛋白轉錄合成效應底物,JAK2、STAT3發生核易位,使疼痛因子得到抑制,以降低神經痛引起的機體不良反應〔20〕。因此本研究推測,Dex可能通過JAK2、STAT3信號通路級聯介導進而抑制疼痛反應。本研究結果表示,Dex可通過與JAK2、STAT3等抑制星形膠質細胞的增殖,且抑制效果高于JAK2、STAT3抑制劑。近來研究證實,JAK2、STAT3通路的激活或抑制對氧化損傷過程有重要作用,Dex可通過激活JAK2、STAT3通路對損傷神經起保護作用,另外,抑制JAK2、STAT3通路轉導可緩解神經損傷因子對膠質細胞、血管內皮細胞的損傷影響〔21〕。

綜上所述,Dex對改善神經疼痛大鼠疼痛表達、病理水平,促進脊髓星形膠質細胞凋亡,抑制JAK2、STAT3蛋白表達具有一定改善作用。