基于網絡藥理學探討四妙丸治療腰椎間盤突出癥的作用機制

朱智濤,陳 鋒,袁 寧,陳祖鵬

(1.廣西中醫藥大學,廣西 南寧 530001;2.廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院,廣西 南寧 530011)

腰椎間盤突出癥(LDH)是常見的脊柱疾病之一,其因主要是腰椎的退行性病變,椎間盤纖維環破裂,椎間盤的正常結構遭到破壞,其中的髓核突出,從而壓迫脊髓及神經根,出現腰腿痛、下肢放射痛等癥狀的腰部綜合征[1-2]。根據流行病學調查,LDH發病率較高,約占人口的1.00%,多見于20～40歲中青年人群,好發于L4～L5及L5～S1椎間[3-4]。隨著智能信息化的滲透,久坐的工作方式較為常見,LDH發病率也因此逐年升高,患病人群的生活質量受到了嚴重影響,也增加了家庭和社會的經濟負擔[5]。使用中藥方劑治療LDH的方法繁多,目前主要有四妙丸、左歸丸、右歸丸、身痛逐瘀湯、甘姜苓術湯、獨活寄生湯等方劑。牛膝、蒼術、薏苡仁、黃柏組成四妙丸,是清濕熱、舒經絡名方之一。目前尚無應用網絡藥理學方法來研究四妙丸對治療LDH作用機制,因此,本研究目的在于分析四妙丸的藥理作用,為臨床上使用四妙丸治療LDH提供可靠依據。

1 資料與方法

1.1文章中運用的數據庫和軟件工具:見表1。本研究經過本院醫學倫理委員會同意。

表1 文章中運用的數據庫和軟件工具

1.2分析四妙丸的化合物及作用靶點蛋白:使用TCMSP選取出四妙丸藥物的化合物成分,收錄標準為:口服利用度(OB%≥30%)、類藥性(DL≥0.18);再參考相關文獻及《中華人民共和國藥典》,對雖然不符合篩選標準但有明確生物活性及藥理作用報道的化合物也納入候選化合物。篩選出來的化合物在DrugBank數據庫進行靶點收集,并通過Uniprot數據庫進行簡稱注釋。

1.3選取LDH的疾病靶點:從OMIM數據庫、GeneCards數據庫、Drugbank數據庫中檢索出關鍵詞“Lumbar disc herniation”,收集LDH發病機制靶點。

1.4四妙丸和LDH的交集靶點的確定:將LDH疾病發病靶點和四妙丸標準化處理后的預測靶點通過R軟件導入Venny作圖平臺,通過映射疾病-四妙丸靶點來構建韋恩圖。映射出交集靶點可能為四妙丸治療LDH的作用靶點。

1.5四妙丸治療LDH主要活性化合物篩選:分別整理四妙丸藥物的活性化合物與作用靶點的相互作用關系,應用Cytoscape軟件構建四妙丸治療LDH的“活性化合物-作用靶點”網絡并進行相關分析,并選取出關鍵活性化合物。

1.6構建蛋白互作網絡圖及核心靶點篩選:將1.4中獲得的作用靶點導入String線上分析平臺進行蛋白互作網絡分析,參數的設置保持默認,構建出作用靶點互作網絡。再利用CytoHubba插件,篩選出四妙丸治療LDH的核心靶點。

1.7四妙丸治療LDH作用靶點功能及信號通路分析:利用R軟件對篩選出交集靶點進行基因本體(GO)富集分析、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析,得出生物過程、分子功能、細胞組成、通路信息。

2 結果

2.1四妙丸的方藥組成及其藥性分類:對四妙丸的4味中藥進行藥性分析,在歸經分類上,多行于腎經、肝經、脾經。功效上多屬化濕藥。性味分類上,多屬于苦味、甘味。見表2。

表2 四妙丸組成藥物的藥性分類

2.2四妙丸的化學成分及靶點預測:結合TCMSP篩選后,可得到四妙丸活性藥物成分75種,其中黃柏37種、牛膝20種、蒼術9種、薏苡仁9種。經DrugBank數據庫匹配后,可得到四妙丸2 902個預測靶點, 分別為蒼術276個,黃柏1 346個,牛膝1 034個,薏苡仁246個。

2.3LDH疾病靶點以及與四妙丸交集靶點的確定:分別在GeneCards、OMIM及Drugbank數據庫中收集到疾病靶點380個、31個及9個,綜合數據去重剔除后,得出LDH的相關發病機制靶點共399個。見圖1。并得出四妙丸與LDH的交集靶點,共45個。見圖2。

圖1 LDH疾病靶點的韋恩圖

圖2 四妙丸與LDH靶點的韋恩圖

2.4四妙丸治療LDH主要活性成分篩選結果:四妙丸治療LDH的“活性化合物-交集靶點”網絡顯示。見圖3。其中有48種化合物成分沒有找到對應疾病靶點,故未參與分析,得到27種有效化合物成分。共四妙丸4種組成藥物的27個活性成分通過調控45個靶點治療LDH,度值排名前2的活性化合物,即關鍵活性化合物為槲皮素(quercetin)、漢黃芩素(wogonin)。

注: :牛膝的化合物成分; :蒼術的化合物成分; :薏苡仁的化合物成分; :黃柏的化合物成分; :“藥物-疾病”的交集靶點;如圓形內有多種顏色,表示此化合物成分存在于多種中藥中,具體見相關顏色。

2.5共同靶點蛋白互作(PPI)網絡構建及分析:對交集靶點構建蛋白互作網絡(PPI)網絡。見圖4。使用Cytoscape的插件CytoHubba篩選出6個作為核心靶點,分別為促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)14、MAPK1、白細胞介素(IL)-6、雌激素受體(ESR)1、FOS核蛋白轉錄因子和JUN原癌基因。見圖5。

圖4 LDH與四妙丸交集靶點的互作網絡圖

圖5 四妙丸治療LDH的核心靶點

2.6交集靶點的GO富集分析及KEGG分析:交集靶點GO富集分析得到GO條目2 004個。其中生物過程1 881個,細胞組成 25個,分子功能98個。富集程度前10見圖6。交集靶點KEGG富集分析得到137條信號通路,富集程度最高的前20條信號通路見圖7。

圖6 四妙丸治療LDH交集靶點富集的GO分析結果圖

圖7 四妙丸治療LDH交集靶點富集的KEGG通路氣泡圖

3 討論

LDH引起的腰腿痛和下肢放射性麻木疼痛是促使患者就診的重要原因,有學者認為當脊髓神經根受到壓迫時,主要表現不是疼痛而是麻木,而炎性反應是腰腿痛的主要原因。中醫方面,LDH歸于“腰痛病”“痹證”的范疇,病機多為“經脈閉阻,腰府失養”,而四妙丸源自《成方便讀》,有清濕熱、利濕濁、通經活絡的功效,是治療腰痛病、痹癥等疾病的經典方劑之一。四妙丸由黃柏、薏苡仁、蒼術、牛膝組成,該方藥方組成較少,但其藥力專一、藥性平穩、組方精煉。現代藥理研究表明該方具有抗炎抑菌、調節免疫、解熱鎮靜、鎮痛等多種藥理作用[6]。

研究得出四妙丸治療LDH的關鍵化合物是槲皮素、漢黃芩素。槲皮素研究表明槲皮素具有抗炎、抗氧化、抗病毒作用[7-8]。孫軍等[9]發現槲皮素對氧化應激損傷有著改善作用。有研究表明漢黃芩素能抗炎是因減少前列腺素E2的表達[10-11]。有前期研究表明漢黃芩素能通過下調腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平達到抑制炎性反應作用[12],而TNF-α與炎性反應關系緊密。因此,四妙丸中關鍵活性化合物的抗炎鎮痛、抗氧化應激的作用可能在治療LDH發揮了重要作用。

PPI網絡結果顯示,四妙丸治療LDH的核心靶點為MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1、FOS和JUN。MAPK14作為MAPK家族中的成員之一,其表達異常與炎性反應密切相關。當機體受到炎性因子、紫外線照射等刺激后,p38MAPK通路得到激活,炎性級聯反應也隨之啟動[13]。IL-6作為機體重要的調節因子,分泌到血清中,并通過IL-6受體α誘導轉錄炎性反應。有研究發現ESR1基因的表達可能會增加膝骨關節炎的患病風險[14]。FOS是神經功能活動的代謝性標志物,參與感覺形成的信息傳遞、調控和整合[15]。另有實驗證實,FOS的陽性表達與傷害性刺激信號的傳入密切相關[16]。JUN存在于神經細胞中,參與疼痛信息的傳遞過程,能對神經傳遞物質、神經沖動、激素和外部刺激等信息做出反應,進行特異性表達的特點[17]。可見,四妙丸可能在抑制炎性反應、阻礙傷害性刺激信號的傳導等過程中發揮重要作用,具有抗炎、抑制神經功能活動的作用。其具體作用機制還需進一步研究。

GO富集分析結果提示,其生物過程體現在對細菌源性分子的反應、對氧化應激的反應等。以上反映在LDH發病過程中較為常見。KEGG富集的通路分析發現涉及多條信號通路,主要包括AGE-RAGE信號通路、IL-17信號通路、TNF信號通路等。AGE-RAGE通路能激活NF-KB,進而刺激促氧化靶基因的表達,加速炎性反應因子的分泌,而大量的炎性細胞因子的表達能觸發相對應的炎性反應,造成持續性細胞損傷及功能紊亂[18]。TNF稱為腫瘤壞死因子,是引起椎間盤退變的主要炎性反應物質之一[19]。IL-17是作為近年來發現的一組促炎因子之一,參與體內的炎性反應[20]。可見四妙丸可能在抗炎、抑制氧化應激反應等途徑上有效地治療LDH,且與目前已知研究結果一致。

綜上所述,四妙丸治療LDH是可能是通過調控MAPK14、MAPK1、IL6、ESR1和FOS的產生,抑制炎性反應、抗氧化應激反應、阻礙傷害性刺激信號的傳入來實現的,該治療過程中槲皮素及漢黃芩素的消炎鎮痛及修復氧化應激損傷的功能可能其中發揮了重要的作用。文章分析出多個藥物有效成分、多個治療靶點及多條信號通路,這也體現出中藥復方多成分-多靶點-多通路治療疾病的特點,為中醫藥臨床治療LDH及進一步研究其相關機制提供了參考。

網絡藥理學的興起是“中醫藥傳承創新發展”的體現,開辟了中醫藥研究的新思路與方法。中醫藥的經驗診療與循證醫學的有機結合是網絡藥理學的表現形式,也是一種新型研究方式。同時,作為一門仍處于初期階段的新興學科,仍存在很多不足與局限性:①受各種平臺數據庫、相關軟件算法的限制,有小部分藥物有效化合物未能找到相對應的靶點,也沒有明確配伍后藥物有效成分是否會發生藥代動力學等性質的改變,如是否能將單味中藥活性成分疊加作為復方活性成分,而中藥在煎制過程中是否有藥性變化。②中藥活性成分確定篩選標準是口服生物利用度、類藥性,但卻忽視了中藥活性成分存在著口服生物利用度低的問題。如人參中的人參皂苷類,口服生物利用度低,但是人參作為拯危救脫、補肺脾氣要藥,在中醫藥治療疾病中有著舉足輕重作用,以口服生物利用度作為標準排除人參皂苷類顯然不合理。③需進一步完善和驗證基因組代謝途徑,以空間關聯為基礎將藥物化合物、靶點、病理-生理過程、疾病進行進一步研究。④需要用動物試驗、臨床試驗等來驗證研究的合理性、降低同質化與偏倚性。網絡藥理學是符合中醫藥的發展原則,隨著研究的不斷深入以及分析手段的更新,現代化技術與中醫藥能更好地有機結合。至此本研究有以下3點建議:①網絡藥理學涉及藥理學、臨床醫學、病理學、人工智能、生物信息學等多種學科,雖然涉及領域廣,但同時單一領域的研究有所不足,需有所側重。②中藥制劑需要與新型制作工藝相結合,如固體分散技術、納米技術、自微乳化釋藥系統、磷脂復合技術等,以達到物盡其效。③目前一些新興起研究方法例如單細胞組學、空間組學尚未與中醫藥系統藥理學進行交會,需突破技術屏障,結合新型研究方法,在原有的研究方法上推陳出新,同時這也需要多學科研究者共同努力。