甲狀腺功能亢進(jìn)性心臟病患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與細(xì)胞因子水平的相關(guān)性

聶子凡,李 波

(1.濱洲醫(yī)學(xué)院,山東 濱州 256603;2.濱洲醫(yī)學(xué)院附屬淄博市中心醫(yī)院心內(nèi)科,山東 淄博 255036)

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的概念首先是由Gershon等在1971年提出來(lái)的,近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明CD4+CD25+Treg細(xì)胞在外周免疫耐受的維持中發(fā)揮著主要的作用,現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)人類外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞與多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及多發(fā)性硬化癥等關(guān)系密切[1-3]。甲狀腺功能亢進(jìn)性心臟病(HHD)是與自身免疫性甲狀腺疾病相關(guān)的心臟疾病[4],但目前關(guān)于Treg細(xì)胞與人類自身免疫性甲狀腺疾病之間關(guān)系或相關(guān)性的研究還比較少,關(guān)于HHD中Treg細(xì)胞的研究更少見。本研究旨在探討HHD患者中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞因子水平的變化與HHD相關(guān)病變指標(biāo)的相關(guān)性,探索CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞改變與自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活動(dòng)狀態(tài),從而有助于了解HHD患者Treg細(xì)胞變化在自身免疫性病變進(jìn)程中的作用和可能的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象與分組

1.1.1HHD組:選擇2021年1月～2022年10月在淄博市中心醫(yī)院心內(nèi)科、普外科和胸外科住院的HHD患者。診斷標(biāo)準(zhǔn):臨床癥狀、體征、彩超、血清甲狀腺自身抗體及細(xì)針穿刺,并依據(jù)文獻(xiàn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn):臨床診斷為HHD,同意參加并配合研究者。排除標(biāo)準(zhǔn):近兩個(gè)月使用過(guò)糖皮質(zhì)激素和(或)免疫抑制類藥物。符合標(biāo)準(zhǔn)的HHD患者共38例,均為女性,年齡25～49歲,平均(39.7±8.5)歲。常規(guī)病理均診斷為甲狀腺功能亢進(jìn)。術(shù)前1～3 d各抽取空腹靜脈血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴運(yùn)輸。

1.1.2正常對(duì)照組:選擇健康志愿者20例,均為女性,年齡24～53歲,平均(38.9±10.2)歲,抽取空腹靜脈血10 ml,置抗凝肝素管,冰浴運(yùn)輸。

1.1.3HHD組:收集2021年10月～2022年8月淄博市中心醫(yī)院外科手術(shù)切除的HHD甲狀腺組織及HHD甲狀腺石蠟包埋組織塊。診斷標(biāo)準(zhǔn):臨床癥狀、體征、彩超、血清甲狀腺自身抗體及細(xì)針穿刺,并依據(jù)文獻(xiàn)[4]。納入標(biāo)準(zhǔn):臨床診斷為HHD且甲狀腺細(xì)針穿刺建議做活檢,而快速病理診斷為甲狀腺功能亢進(jìn),并伴有心律失常、心臟增大和心力衰竭。并且未使用過(guò)糖皮質(zhì)激素和免疫抑制類藥物。排除標(biāo)準(zhǔn):使用過(guò)糖皮質(zhì)激素和免疫抑制類藥物。符合標(biāo)準(zhǔn)的HHD甲狀腺石蠟包埋組織共20例,均為女性。年齡21～53歲,平均(41.2±9.9)歲。

1.1.4正常對(duì)照組:正常甲狀腺15份為距甲狀腺囊腫或距甲狀腺瘤1 cm以外的甲狀腺組織及甲狀旁腺切除術(shù)所切除的小塊甲狀腺組織。其中臨床診斷甲狀腺囊腫4份,甲狀腺瘤6份,甲狀旁腺切除術(shù)5份。正常對(duì)照組均為女性,年齡23～54歲,平均(42.1±10.7)歲。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),HHD甲狀腺石蠟包埋組與正常對(duì)照組年齡比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.514,P>0.05),HHD甲狀腺組與正常對(duì)照組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.612,P>0.05)。本次研究經(jīng)過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)同意。

1.2方法:采用免疫組化染色方法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)HHD患者和正常人甲狀腺組織中CD25和Foxp3分子的陽(yáng)性表達(dá)及分布情況。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)正常對(duì)照和HHD患者術(shù)前外周血中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞數(shù)量變化;通過(guò)電化學(xué)發(fā)光技術(shù)分析HHD血清中甲狀腺過(guò)氧化物酶抗體(TPOAb)和甲狀腺球蛋白抗體(TGAb)水平;分析Treg細(xì)胞數(shù)量變化與甲狀腺自身抗體和甲狀腺細(xì)胞病理改變的相關(guān)性;通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)外周血白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-2、干擾素-γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-4、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)及IL-10水平并同時(shí)分析它們與Treg細(xì)胞的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1HHD患者甲狀腺組織病理變化及血清抗體改變的主要特征:HHD患者彩超結(jié)果顯示甲狀腺呈現(xiàn)彌漫性腫大,峽部錐體葉腫大,被膜粗厚,內(nèi)部回聲呈網(wǎng)狀CDFI血流信號(hào)豐富,與正常對(duì)照組血清TGAb(26.4±12.1)IU/ml比較,HHD組血清TGAb(325.5±78.2)IU/ml、TPOAb(140.1±63.7)IU/ml明顯增高。病理學(xué)分析可見,HHD甲狀腺呈現(xiàn)彌漫性腫大,峽部錐體葉腫大,腺體質(zhì)地較韌,組織學(xué)分析時(shí)可見切面呈分葉狀,色灰白灰黃,有時(shí)變黑。顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),甲狀腺實(shí)質(zhì)組織廣泛破壞,萎縮,較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),淋巴濾泡形成,纖維組織增生,有時(shí)可出現(xiàn)多核巨細(xì)胞。甲狀腺組織內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)指數(shù)顯著提高(表1)。而正常對(duì)照組甲狀腺組織的甲狀腺濾泡發(fā)育成熟,濾泡腔充滿膠質(zhì),分布均勻,濾泡呈小葉狀排列,小葉周圍有少量纖維組織和血管,未見炎細(xì)胞浸潤(rùn)。

表1 HHD甲狀腺組織內(nèi)的炎細(xì)胞浸潤(rùn)指數(shù)(n)

2.2HHD外周血Treg細(xì)胞的變化及與細(xì)胞因子水平、自身抗體、病理改變的相關(guān)性:HHD患者外周血Treg細(xì)胞的比例(0.81±0.26)%,明顯低于正常對(duì)照組的(2.50±0.69)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),而CD4+CD25+T細(xì)胞的比例明顯高于正常對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見圖1、圖2)。HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平與正常對(duì)照組比較明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),IL-4、TGF-β及IL-10與正常對(duì)照組比較明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(見表3)。Treg頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511,P<0.05),與TGAb、 TPOAb呈負(fù)相關(guān)(r=-0.477、-0.485,P<0.05)。與IL-4無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.317,P>0.05),但與IL-10、TGF-β水平正相關(guān)(r=0.714、0.525,P<0.05),與IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.536、-0.673、-0.512、-0.498,P<0.05)。

圖2 兩組外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測(cè)

表3 HHD患者外周血IL-6、IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-4、TGF-β及IL-10測(cè)定結(jié)果

2.3HHD患者甲狀腺組織中Foxp3+、CD25+、Treg細(xì)胞表達(dá)水平及與細(xì)胞因子水平、自身抗體、病理改變的相關(guān)性:Foxp3+細(xì)胞在正常甲狀腺主要分布于甲狀腺濾泡附近,在HHD甲狀腺主要分布在淋巴濾泡的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上,與正常對(duì)照組比較數(shù)量顯著下降 (P<0.05)(見表4、圖3)。CD25+細(xì)胞在正常甲狀腺主要分布于甲狀腺濾泡附近,在HHD甲狀腺主要分布在淋巴濾泡的浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞上,在甲狀腺細(xì)胞密集的區(qū)域,CD25也有不同程度的表達(dá)。HHD甲狀腺CD25陽(yáng)性表達(dá)明顯高于正常甲狀腺(P<0.05)(見表4、圖3)。與CG組甲狀腺Treg細(xì)胞比例(3.52±0.78)%比較,HHD甲狀腺Treg細(xì)胞比例(1.21±0.79)%明顯減低(P<0.05),而CD4+CD25+T細(xì)胞比例明顯增高(P<0.05)(見圖4、圖5)。HHD甲狀腺Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.478,P<0.01)。HHD甲狀腺中Treg的頻數(shù)與TGAb、TPOAb呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497,-0.489,P<0.05)。HHD甲狀腺Treg與外周血IL-4無(wú)顯著相關(guān)性(r=0.297,P>0.05),與血中IL-10、TGF-β水平呈正相關(guān)(r=0.682、0.517,P<0.05)。與血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.476、-0.652、-0.523、-0.491,P<0.05)。

圖3 兩組甲狀腺組織中Foxp3和CD25的表達(dá)(DAB,×400)

圖4 兩組甲狀腺組織CD4+CD25+Treg流式檢測(cè)

圖5 兩組甲狀腺CD4+CD25+Foxp3+Treg流式檢測(cè)

表4 HHD組甲狀腺組織中CD25和Foxp3的表達(dá)(n)

3 討論

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一組具有免疫抑制功能的T細(xì)胞亞群,CD4+CD25+Treg細(xì)胞是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞家族中最主要的亞群,其具有免疫無(wú)能和免疫抑制作用[5]。其特征性的分子標(biāo)記是Foxp3。Foxp3被認(rèn)為是促進(jìn)CD4+CD25+T細(xì)胞分化成熟以及維持其功能的主要調(diào)控子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠自身免疫性疾病的發(fā)生與CD4+CD25+Treg細(xì)胞有密切的關(guān)系,其體內(nèi)Treg細(xì)胞的缺乏可導(dǎo)致自身免疫性胃炎、腸炎和I型糖尿病等多種自身免疫性疾病產(chǎn)生,而外源性補(bǔ)充CD4+CD25+Treg細(xì)胞則可逆轉(zhuǎn)自身免疫性疾病的病理進(jìn)程[6]。HHD是一種自身免疫性疾病,本病為自身免疫病的佐證如下:本病患者外周血及組織中輔助T細(xì)胞及其細(xì)胞因子異常,血清中抗甲狀腺抗體包括TGAb與TPOAb常明顯升高。本研究提示HHD甲狀腺內(nèi)大量活化的效應(yīng)性T細(xì)胞的存在可能是其CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量增加的原因,HHD甲狀腺內(nèi)Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的下降則是導(dǎo)致其對(duì)自身反應(yīng)性T細(xì)胞調(diào)節(jié)失控的主要原因。Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量的下降與甲狀腺中的免疫失衡有著密切的關(guān)系。

自身免疫性甲狀腺疾病患者存在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目和功能異常[7]。黃廣英等[8]研究發(fā)現(xiàn),自身免疫性甲狀腺疾病患者甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目減少,Foxp3+CD4+CD25+細(xì)胞比例減少更為明顯,而活化CD4+細(xì)胞數(shù)目增加,提示自身免疫性甲狀腺疾病患者由于甲狀腺內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目減少,調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能被抑制,自身反應(yīng)性T細(xì)胞活化。該研究還發(fā)現(xiàn)自身免疫性甲狀腺疾病患者甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中凋亡細(xì)胞的比例比CD4+CD25-細(xì)胞中凋亡細(xì)胞比例明顯增多,提示患者甲狀腺內(nèi)的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)凋亡的易感性增加,進(jìn)入凋亡過(guò)程,使得甲狀腺內(nèi)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)目減少,導(dǎo)致調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與自身反應(yīng)性T細(xì)胞活性不匹配,引發(fā)自身免疫性甲狀腺疾病。本研究利用透膜技術(shù)在CD4和CD25標(biāo)記的基礎(chǔ)上把Foxp3作為標(biāo)記,能更好地反映Treg細(xì)胞的真實(shí)水平,研究發(fā)現(xiàn):HHD組甲狀腺與CG組甲狀腺比較,CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞比例明顯減低;HHD患者外周血CD4+CD25+Foxp3+的比例明顯也低于正常對(duì)照組;并且HHD甲狀腺和外周血Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明HHD患者體內(nèi)存在免疫反應(yīng)紊亂,Treg細(xì)胞參與了HHD甲狀腺病理進(jìn)程。

對(duì)于甲狀腺功能亢進(jìn)患者的細(xì)胞因子的研究可見少量報(bào)道[9]。本課題發(fā)現(xiàn)HHD組患者外周血IL-2、IL-6的水平與正常對(duì)照組相比明顯升高,IL-4與CG組相比明顯降低;HHD患者外周血中IL-10、TGF-β的含量也降低,同時(shí)Treg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例與IL-10、TGF-β的含量呈正相關(guān)。Treg細(xì)胞活化后主要通過(guò)細(xì)胞接觸依賴機(jī)制或抑制性細(xì)胞因子依賴機(jī)制主動(dòng)發(fā)揮免疫抑制作用,其可分泌大量的IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子,用相應(yīng)抗體中和此類細(xì)胞因子則其體內(nèi)免疫抑制作用降低,說(shuō)明Treg細(xì)胞的功能可以通過(guò)這些抑制性細(xì)胞因子來(lái)實(shí)現(xiàn)[10]。這些細(xì)胞因子具有抑制抗原呈遞細(xì)胞及拮抗效應(yīng)性T細(xì)胞的功能,在Treg細(xì)胞介導(dǎo)的免疫耐受及Treg細(xì)胞的產(chǎn)生和增殖中發(fā)揮著重要作用[11-12]。因此本研究推測(cè)可能由于HHD患者外周血中Treg細(xì)胞數(shù)量的減少,能夠發(fā)揮有效免疫抑制作用的細(xì)胞數(shù)減少,導(dǎo)致自身反應(yīng)性T細(xì)胞激活增多,凋亡減少。同時(shí)Treg細(xì)胞減少,產(chǎn)生抑制性細(xì)胞因子的含量降低,抑制能力下降,導(dǎo)致激活的自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞增多。本研究結(jié)果表明,HHD患者血清TNF-α水平顯著高于CG組,其升高原因初步分析為:由于患者存在自身免疫功能缺陷,特別是組織免疫受到抑制,過(guò)量的TNF-α刺激單核一巨噬細(xì)胞的結(jié)果,是否還有其他因素影響,尚待進(jìn)一步探討。本課題還發(fā)現(xiàn),HHD患者血清IFN-γ水平也顯著高于CG組,并與外周血和甲狀腺Treg相關(guān),表明TNF-α、IFN-γ與HHD的細(xì)胞免疫下降有關(guān),TNF-α、IFN-γ共同參與了HHD的發(fā)病,可以作為HHD免疫狀態(tài)的檢測(cè)指標(biāo)。

為進(jìn)一步證實(shí)Th1、Th2細(xì)胞因子的水平以及研究HHD患者體內(nèi)Th1、Th2與Treg之間的關(guān)系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)HHD患者外周血IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平與CG組比較明顯升高。IL-4、TGF-β及IL-10與CG組比較明顯降低。HHD患者外周血Treg與IL-4無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。HHD患者甲狀腺和外周血Treg與血中IL-10、TGF-β水平呈正相關(guān),與血中IL-2、IL-6、IFN-γ和TNF-α水平呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)患者體內(nèi)降低的CD4+CD25+Foxp3+Treg不能抑制體內(nèi)的自身免疫反應(yīng),促進(jìn)了Th1類細(xì)胞因子分泌,另一反面Th1類細(xì)胞因子抑制體內(nèi)效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)度增值和活化。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),HHD甲狀腺和外周血Treg的頻數(shù)與甲狀腺組織的炎性反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明Treg參與了HHD病理進(jìn)程,與HHD發(fā)病明顯相關(guān)。另外還有研究發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、IL-12、IL-18等在體外可以明顯下調(diào)Treg細(xì)胞的抑制作用[13]。因此外周血中Treg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)性T細(xì)胞抑制作用失控的原因還需進(jìn)一步的研究。

HHD患者血清中TPOAb和TGAb均有不同程度的升高。甲狀腺微粒體抗體是針對(duì)甲狀腺微粒體的一種抗體,靶抗原為甲狀腺過(guò)氧化物酶,TPO是一種與膜結(jié)合的血紅素蛋白,是甲狀腺激素合成的關(guān)鍵酶,也是引起自身免疫性甲狀腺疾病的一個(gè)重要的自身抗原,其與TPO抗體(TPOAb)的免疫反應(yīng),會(huì)引起自身免疫性甲狀腺疾病患者的臨床癥狀的變化。甲狀腺球蛋白(Tg)占全部甲狀腺蛋白的75%,是由甲狀腺濾泡細(xì)胞合成的一種糖蛋白,為甲狀腺濾泡膠體及細(xì)胞內(nèi)基質(zhì)的主要成分。TGAb是自身免疫性甲狀腺疾病患者血清中的一種常見自身抗體。本課題研究發(fā)現(xiàn),HHD患者血清TGAb、TPOAb與CG組比較明顯升高,為進(jìn)一步證實(shí)TGAb、TPOAb的水平與Treg之間的關(guān)系,本研究分析了CD4+CD25+Foxp3+Treg與TGAb、TPOAb之間的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)HHD甲狀腺Treg的頻數(shù)與TGAb、 TPOAb呈負(fù)相關(guān);HHD外周血Treg的頻數(shù)與TGAb、 TPOAb呈負(fù)相關(guān);這可能與HHD患者細(xì)胞免疫功能低下有關(guān),而HHD患者體液免疫功能增強(qiáng)有關(guān),B細(xì)胞活化產(chǎn)生大量的自身抗體,這可能是由于Treg細(xì)胞數(shù)量減少,不能正常抑制B細(xì)胞的功能。

綜上所述,HHD 患者甲狀腺Treg細(xì)胞的數(shù)量下降,活化的自身反應(yīng)性T細(xì)胞大量增加,并因此造成甲狀腺內(nèi)免疫調(diào)節(jié)失控。HHD患者甲狀腺和外周血CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞明顯減少,并且與細(xì)胞因子、甲狀腺自身抗體及甲狀腺病理相關(guān),這群調(diào)節(jié)性T細(xì)胞可能通過(guò)細(xì)胞因子和甲狀腺自身抗體參與了HHD的病理進(jìn)程。