肥厚型心肌病關鍵基因的鑒定及鐵死亡機制

巴文強,李 艷,李夢媛

(1.吉安市中心人民醫院藥劑科,江西 吉安 343000;2.吉安市第三人民醫院心理科,江西 吉安 343000;3.南京醫科大學第二附屬醫院藥學部,江蘇 南京 210011)

肥厚型心肌病(HCM)是以心肌肥厚為主要特點,嚴重患者可能會并發房顫、心力衰竭及心源性猝死等。HCM的病因多種多樣,最常見的是肌節蛋白基因突變[1-2]。然而,其相關致病基因未完全闡明,且缺乏有效的治療方法。因此,鑒定HCM發生發展過程中的關鍵基因可能有助于揭示其致病機制和發現特異性治療靶點,對其診斷和治療具有重要意義。此外,鐵死亡是一種非凋亡形式的細胞死亡,已被證實與多種類型心肌病的發生發展有關,但其對于HCM的確切作用仍未明確[3]。因此,本研究旨在通過生物信息學方法,識別HCM的關鍵基因,探索其發病機制與鐵死亡機制,為該病的診斷和治療提供新思路。

1 資料與方法

1.1數據收集:以“hypertrophic cardiomyopathy”為關鍵詞在GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)數據庫中檢索HCM樣本的基因表達芯片。納入標準:①數據樣本來自人類心臟組織;②數據樣本應包括HCM患者和健康對照;③HCM組和對照組數據樣本數均大于3例。排除標準:患者參加過藥物或其他治療的臨床試驗。經過篩選,最終在507個相關數據集中選擇下載GSE36961和GSE32453數據集。其中GSE36961數據集,平臺號為GPL15389 Illumina HumanHT-12 V3.0 expression beadchip,包含HCM組患者106例,對照組39例;GSE32453數據集,平臺號為GPL6104 Illumina humanRef-8 v2.0 expression beadchip,包含HCM組患者8例,對照組5例。

1.2差異表達基因(DEGs)的篩選:GEO2R(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)是一個基于GEOquery和Limma R包的交互式網絡工具,可以比較GEO系列中的兩組或多組樣本,以識別在不同實驗條件下表達差異的基因。利用GEO2R篩選DEGs,篩選參數標準為P<0.05,|Log2(Fold change)|>0.6。利用Venny 2.1在線工具(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)獲得GSE36961和GSE32453數據集的共同DEGs。

1.3富集分析:將共同DEGs上傳至Metascape數據庫(https://metascape.org/)進行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析。基中GO富集包括生物過程(BP)、細胞組成(CC)及分子功能(MF)。物種設定為“Homo sapiens”,P<0.05。富集結果通過微生信網站(http://www.bioinformatics.com.cn/)進行可視化。

1.4蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建:將共同DEGs上傳至STRING11.5平臺(https://string-db.org/),設定置信度大于0.9,選擇物種為“Homo sapiens”,獲得PPI數據。將數據導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理,使用CytoHubba插件的Degree、DMNC、MCC、MNC、Radiality算法篩選關鍵基因。

1.5驗證關鍵基因在HCM中的表達:使用GSE1145數據集(平臺號為GPL570 [HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array,包含HCM組患者5例,對照組11例)驗證關鍵基因在HCM中的表達水平,兩組數據比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。

1.6受試者工作特征(ROC)曲線分析:繪制關鍵基因的ROC曲線,比較關鍵基因在HCM中的診斷效能。ROC曲線的曲線下面積(AUC)在0.5～1。AUC越接近于1,說明診斷效果越好。其中,AUC在0.9以上有較高的準確性,在0.7～0.9區間有一定準確性,在0.5～0.7區間有較低準確性[4]。

1.7鐵死亡調控基因獲取及其與HCM共同DEGs綜合分析:以“ferroptosis”為關鍵詞,在Genecards(https://www.genecards.org/)和FerrDb(http://www.zhounan.org/ferrdb/current/)數據庫中查詢與鐵死亡相關的基因。其中FerrDb數據庫下載鐵死亡過程的標記基因、驅動基因和抑制基因。利用Venny 2.1在線工具將鐵死亡相關基因與HCM共同DEGs進行映射,得到鐵死亡調控HCM的基因。將這些基因上傳至Metascape數據庫進行KEGG通路富集分析,并用STRING11.5平臺構建PPI網絡。

2 結果

2.1DEGs篩選:利用GEO2R工具篩選DEGs,GSE36961數據集中共鑒定出600個DEGs,其中上調基因228個,下調基因372個,見圖1(A);GSE32453數據集中共鑒定出987個DEGs,其中上調基因518個,下調基因469個,見圖1(B)。

2.2共同DEGs的獲取:將GSE36961和GSE32453數據集鑒定出的DEGs上傳至Venny 2.1網站,得到共同DEGs。其中得到共同上調基因67個及共同下調基因69個,共計136個共同DEGs。見圖2。

注:A:上調基因;B:下調基因

2.3富集分析:GO富集分析結果見圖3(A)。其中BP主要涉及系統過程的調節、細胞絲裂原活化蛋白激酶級聯調控、肌肉肥大等,CC主要是肌動蛋白細胞骨架、黏著斑、肌小節等,MF富集最多為G蛋白偶聯受體結合、鈣離子結合、磷脂酰肌醇3-激酶結合等。KEGG富集分析結果見圖3(B),得到的生物學信號主要為流體剪切應力和動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化和糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體信號通路等。

2.4PPI網絡的構建及關鍵基因篩選:運用STRING11.5數據庫構建PPI網絡,使用Cytoscape 3.7.2進行可視化。PPI網絡及CytoHubba插件5種算法的可視化見圖4。將5種算法得到的前10位基因的交集作為關鍵基因,最終得到4個關鍵基因:Fos原癌基因(FOS)、趨化因子配體2(CCL2)、CCAAT增強子結合蛋白Delta(CEBPD)和Pim-1原癌基因(PIM1)見圖5。

圖4 PPI網絡圖

圖5 5種算法前10位基因交集韋恩圖

2.5驗證關鍵基因在HCM中的表達:提取4個關鍵基因在GSE1145數據集HCM組和對照組中的表達量并進行可視化分析,見圖6,其中CCL2、CEBPD和PIM1在HCM中表達下調且具有統計學意義(均P<0.05),而FOS在HCM中的表達與對照相比較差異無統計學意義(P=0.27)。

圖6 4個關鍵基因在對照和HCM中的表達差異小提琴圖

2.6ROC曲線分析:用ROC曲線的AUC值比較4個關鍵基因在HCM中的診斷效能,結果見圖7。CCL2對HCM的診斷有較高的準確性(AUC為0.982),CEBPD和PIM1對HCM的診斷有一定的準確性(AUC在0.7～0.9區間)。

圖7 4個關鍵基因的ROC曲線

2.7鐵死亡調控基因獲取及其與HCM共同DEGs綜合分析:在FerrDb和Genecards數據庫中查詢得到鐵死亡相關基因共959個,將這959個基因與上述136個共同DEGs進行映射,得到10個與HCM相關的鐵死亡調控基因(圖8)。對這10個基因繪制PPI網絡(圖9)并進行KEGG通路富集分析,共得到流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等6條信號通路(圖10)。

圖8 鐵死亡調控基因與共同DEGs的韋恩圖

圖9 PPI網絡圖

圖10 HCM相關鐵死亡調控基因的KEGG富集分析

3 討論

HCM是一種常染色體顯性遺傳病,是目前國內外引起青少年及運動員猝死的主要原因。HCM在全球普通人群中的患病率至少為0.2%,中國成年人HCM患病率為80/10萬[1,5],值得引起重視。引起HCM的病因多種多樣,過往研究證實有超過29個基因的1 500余種突變可導致HCM,其中40%～60%是由編碼肌小節結構蛋白的基因突變所致[1-2]。然而,HCM的具體發病機制還有待進一步確定。

利用生物信息學方法鑒定疾病突變的關鍵基因和探究發病機制是目前研究的熱點。本研究通過GEO數據庫下載與HCM相關的GSE36961和GSE32453數據集,篩選得到136個共同DEGs,KEGG富集分析顯示主要信號通路為:流體剪切應力和動脈粥樣硬化、脂質與動脈粥樣硬化和糖尿病并發癥中的晚期糖基化終產物及其受體信號通路等,PPI網絡共鑒定出4個關鍵基因:FOS、CCL2、CEBPD、PIM1,基中CCL2、CEBPD、PIM1基因表達量在GSE1145數據集中得到了驗證。

CCL2又稱MCP-1,其主要功能是特異性趨化單核/巨噬細胞、T淋巴細胞,可引起心肌的纖維化及血管壁平滑肌細胞增殖,其通過趨化作用和對整合素的活化促進炎性反應細胞的遷移,參與機體炎性反應的發生和維持[6-7]。在心臟損傷和肥厚性重構的過程中,心肌炎性反應的發生會誘導心肌病理性肥大和心肌纖維化,最終導致心肌細胞死亡的不良結局[8]。MCP-1作為促炎性因子,還會損傷血管內皮細胞,降低一氧化氮活性,發生血管痙攣;同時發揮趨化作用,誘導循環和組織中的巨噬細胞在受損血管中浸潤,分泌細胞因子,促進平滑肌細胞增殖和遷移,加快血管斑塊的形成[9]。本研究發現CCL2在HCM中表達下調,且對HCM有較高的診斷效能,因此認為CCL2可能是HCM發病機制中的關鍵基因。

CEBPD是一種無內含子基因,編碼屬于CEBP家族的269個氨基酸的蛋白質,一種被認為參與細胞分化、代謝和免疫應答反應的轉錄因子。過往研究表明,CEBPD在炎性反應刺激反應中起著關鍵作用[10],而心肌病理性肥大的發生與炎性反應信號因子的釋放和免疫細胞的激活有關[11]。本研究發現CEBPD在HCM患者的心肌組織中表達下調,且對HCM有一定的診斷效能,因此認為CEBPD可能是HCM發展過程中的關鍵基因。

HCM患者與正常患者相比血流動力學會發生顯著變化,這導致層流切應力也會相應的改變。有研究發現,層流切應力會顯著上調PIM1的表達,而PIM1對6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(PFKFB3)存在負調控作用,同時PFKFB3作為內皮細胞糖酵解途徑的關鍵酶,因此認為PIM1可能通過PFKFB3信號分子在層流切應力調節內皮細胞糖酵解中發揮重要作用[12]。既往研究表明,在心肌病理性肥大的發展過程中,心肌細胞減少了葡萄糖的氧化,增加了糖酵解和其他形式的代謝[13],這種細胞代謝方式的轉變直接誘導或促進了心肌病理性肥大的發生[14]。而線粒體功能障礙是這一過程公認的潛在機制[15-16]。同時,PIM1在維持心肌細胞線粒體穩態中也起著關鍵作用[17]。結合本研究發現PIM1在HCM患者的心肌組織中表達下調,且對HCM有一定的診斷效能,因此認為PIM1可能是HCM發展過程中的關鍵基因。

本研究進一步分析了HCM可能的鐵死亡機制,得到活化轉錄因子 3(ATF3)、溶血磷脂酰膽堿酰基轉移酶3(LPCAT3)和PIM1等10個與HCM相關的鐵死亡調控基因,對這10個基因進行KEGG通路富集分析,共得到流體剪切應力和動脈粥樣硬化、鐵死亡等信號通路。ATF3是ATF/CREB轉錄因子家族中的一員,是一個已知的氧化應激反應基因。研究發現,ATF3通過負調控MEK-ERK1/2和JNK通路在心肌肥厚的發生發展過程中發揮關鍵作用[18]。跨膜蛋白轉運載體家族7成員11(SLC7A11)是鐵死亡通路中的關鍵基因,通過參與還原型谷胱甘肽合成、脂質過氧化物的氧化還原調控鐵死亡[19]。內源性谷胱甘肽的生物合成依賴于谷氨酸/胱氨酸反向轉運體(system Xc-)系統,其由SLC7A11和單通道跨膜調控蛋白家族3成員2(SLC3A2)組成,system Xc-系統可通過1∶1交換谷氨酸和胱氨酸來調節鐵死亡[20]。研究表明,ATF3可抑制system Xc-系統,并通過抑制SLC7A11的表達使細胞更易發生鐵死亡[21]。多不飽和脂肪酸易受脂質過氧化影響,是發生鐵死亡的必要條件。LPCAT3參與細胞膜中多不飽和脂肪酸的生物合成和重塑,在氧化應激狀態下,細胞可激活LPCAT3誘導脂質過氧化反應。當多不飽和脂肪酸被催化生成脂質過氧化物,會進一步破壞細胞形態及功能,如細胞膜缺陷及線粒體收縮功能障礙,最終誘發鐵死亡[22]。

鐵死亡是近年來發現的一種鐵依賴的、非凋亡形式的調節性細胞死亡,其在心肌病的發生發展中扮演著重要角色。目前對于心肌病狀態下鐵代謝紊亂及鐵死亡的探索和認識仍處于起步階段。本研究篩選出了10個鐵死亡相關基因及信號通路,然而這些鐵死亡基因的確切機制和相關信號通路仍不明確,在后續研究中應對鐵死亡基因在HCM發展過程中的生物學功能進行細胞學實驗驗證。