超高效液相色譜法測定紫杉醇注射液中的有關物質分析

吳姍娜,盧桂清

(廈門大學附屬第一醫院,福建 廈門 361000)

紫杉醇是從紅豆杉植物中提取出來的,屬于抗腫瘤藥物,在臨床得到廣泛應用,用于治療非小細胞肺癌、子宮內膜癌和膀胱癌等[1-2]。微管蛋白可以與紫杉醇結合,細胞在G2/M期能夠進行有絲分裂阻滯,促使腫瘤細胞增殖受到抑制。紫杉醇無法與水相溶,臨床紫杉醇抑制劑包含多種類型。通過分析生物樣本中紫杉醇的含量,通常采用高效相色譜方法,但是分析靈敏度不高,不同生物樣品,特異性存在差異,消耗時間較長[3-4]。如今液相色譜技術發展迅猛,選擇性和靈敏度較高,成為檢測藥物中物質的首選方案。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇高效液相色譜儀、全自動進樣器、高靈敏光纖型紫外檢測器(設備來源為Thermo Fisher Scientific公司),乙腈、紫杉醇對照品、無水乙醇(所選物質來源為BASF公司,批號為31163947G0)、純化水系統、渦旋混合器、四級桿質譜檢測器。

1.2 研究方法

1.2.1 配置儲備液

精密稱定10mg紫杉醇,甲醇溶解,定容到50mL,之后搖勻,得到紫杉醇標準儲備液,避光儲存,儲存溫度為4℃。吸取標準儲備液,采用濃度為50%的甲醇溶液,進行稀釋處理,配置濃度范圍為0.05～20μg/m L,稀釋到0.1μg/mL、2.5μg/mL、20μg/mL,稀釋后的溶液為質控點工作液。

1.2.2 配置內標溶液

稱取7.5mg炔諾酮,作為對照品,甲醇溶液,定容到25mL,得到濃度為300μg/mL的炔諾酮內標儲備液,避光儲存,放置在零下20℃。內標溶液為使用甲醇稀釋1000倍的炔諾酮內標儲備液(0.3μg/mL)。

1.2.3 配置緩沖液

稱取甲酸鹽(稱取量為1.26g),定容25mL,使用純水稀釋母液,稀釋倍數為1000倍,得到緩沖液,緩沖液濃度為0.2mmol/L。各儲備液,內標溶液與標準系列溶液以相同體積,應用校正的容量瓶,與移液進行配置,放置在冰箱內,進行避光存儲,保存備用。

1.2.4 色譜條件

色譜柱:流動相A為水,B為乙腈 梯度洗脫(5分鐘以內濃度為40%,5～11分鐘濃度為40%～80%;10～11分鐘濃度為80%);檢測波長設置為227nm,柱溫設置為40℃,流速為每分鐘0.6mL。

1.2.5 系統適用性溶液

選取30mg紫杉醇對照品,測定精密,將其放置在25mL量瓶中,添加0.01mol/L氫氧化鉀甲醇溶液,溶液為1mL,搖動1分鐘后,使用濃度為0.1%的冰醋酸乙醇溶液進行稀釋,搖勻處理。

1.2.6 系統適用性溶液

精密稱取三種雜質對照品,使用乙醇溶液進行稀釋,稀釋后的紫杉醇為0.5mg/mL,選擇適量雜質,雜質1、雜質2各為 2.5 μg/mL,雜質3為 25μg/mL的溶液。選取無水甲醇溶液和聚氧乙烯35蓖麻油適量,精密稱取25mg紫杉醇作為對照品,放置在20mL量瓶中,使用甲醇溶液進行稀釋,搖勻處理,稱量1mL上述溶液,放置在100mL量瓶中,搖勻處理。

1.2.7 測定色譜條件

強制降解試驗法,選取紫杉醇注射液,進行酸、高溫、堿降解,制成0.5 mg/mL 的溶液,分別進樣。(1)酸破壞試驗,添加1.0 mol/L的鹽酸,鹽酸含量2mL,放置在溫度25℃環境中,放置時間為2小時,之后加入1.0mol/L的氫氧化鈉2mL中和,使用甲醇定容,搖勻處理。

1.3 觀察指標

(1)強制降解試驗;(2)分析準確度考核結果;(3)線性分析。

2 結果

2.1 強制降解試驗

紫杉醇具有不穩定性,在各種降解條件下,實施降解處理,測定降解雜質不干擾目標,在光照條件下,以及堿條件下,會增加雜質數量和雜質質量,在酸、光照與堿條件下,原料峰值面積會降低90%左右,不同雜質峰之間分離良好。

2.2 分析準確度考核結果

原有量為1.5μg/mL,加入量為0.49μg/mL,則測得量為1.99μg/mL,回收率為99.3%,標準偏差為2.95%。原有量為0.98μg/mL,測得量為2.46μg/mL,回收率為99.3%,標準偏差為2.38%。原有量為1.5μg/mL,加入量為1.45μg/mL,測得量為2.94μg/mL,回收率為99.6%,標準偏差為1.5%。

2.3 線性

波長為225nm,標準偏差為0.89%,雜質個數為5個;溫度為38℃,標準偏差為0.89%,雜質個數為5個;流速為0.54ml/min,標準偏差為2.49%,雜質個數為5個;色譜柱為1個,標準偏差為1.79%,雜質個數為5個。

3 討論

應用超高液相色譜儀,對色譜條件進行優化,促使檢測時間縮短[5-6]。由于紫杉醇水溶性較弱,如果使用傳統紫杉醇注射液,需要將無水甲醇與聚陽已烯麻油相互混合作為增溶劑[7-8]。在紫杉醇外吸收波長,可以觀察到輔助色譜峰。文章設置空白對照溶液,促使機械和輔料的干擾峰得以排除。

進樣體積需要得到優化,為促使要點方法的延續性得到保障。文章所選供試品及對照品的溶液,具有相同濃度,色譜柱體積與進樣體積之間呈現正比例特點,最后能夠計算出進樣體積。在實驗過程中,可以將進樣體積設置為1,促使有關物質的檢出率得到保證。

優化梯度洗脫程序,為促使梯度變化不會對分離效果產生影響,需要保持不同規格色譜柱的洗脫體積倍數相同。在藥典方法中,有機相比例在20分鐘以內,從40%逐漸上升到80%。時間為25分鐘,計算出梯度段時間為5分鐘。預估其他梯度洗滌時間,可以促使結果進一步優化。

分析不同流速、不同柱溫,對紫杉醇以及各雜質的分離情況,結果發現,在各種分離條件均滿足情形下,選擇為每分鐘0.6mL的速度。可以促使要求達到滿足,分析時間減少,柱溫40℃時,紫杉醇能夠與雜質相互分離。

細致優化色譜和質譜條件,包括評估與流動相添加劑相關的加合物離子的情況。通過采用氣相色譜方式,通過分析紫杉醇在含不同添加劑的溶液或流動相中規律,采用上述方式,對溶液中添加劑種類、濃度等條件作出締選的結果高度一致。說明在建立紫杉醇定量方法時,采用高效液氣相色譜是一種可行的優化方案[9-10]。上述方式具有經濟環保、高效特點,是分析紫杉醇的重要方法,具有可靠性和有效性。通過分析紫杉醇裂解規律,發現紫杉醇質譜特點,說明紫杉醇特征性碎片例子。通過采用分離鑒定方式,鑒定紫杉醇在人體中的代謝物,推測出代謝物的代謝途徑與產物。紫杉醇裂解期間,主要核心內容為脫水和酷鍵斷裂,其中碎片離子數量較多,同時穩定性較好[11-12]。紫杉醇包含3個代謝物,主要代謝物為6α-羥基。通過分析紫杉醇代謝物質譜行為,通過定量分析,或者質譜定性分析方式,能夠提供良好參考。本次研究所用方案,生物品檢測與高通量要求需要得到滿足,在注射階段,使用紫杉醇聚合物膠束,檢測結果更加良好。

綜上所述,文章結果發現高效液相色譜法測定紫杉醇注射液相關物質含量具有良好耐用性和靈敏度,為注射紫杉醇制劑的有關物質檢測提供良好方法。