人凝血因子Ⅷ血管刺激性和溶血性試驗研究

張麗鈴，黃璠，劉明星

（1.廣東丹霞生物制藥有限公司，廣東韶關 512029；2.廣東省血漿蛋白質工程技術研究中心，廣東韶關 512029）

人凝血因子Ⅷ（human coagulation factor Ⅷ，F Ⅷ）是一種大分子量糖蛋白復合物，在血漿中含量極少，1 mL 血漿中僅含100 ～150 ng，在血液循環中參與人體內源性凝血過程，若含量不足或功能缺陷，易引起凝血障礙性疾病，即甲型血友病（占血友病發病率的80%），臨床上廣泛采用F Ⅷ制劑用于甲型血友病患者出血替代治療[1-2]。F Ⅷ作為一種生物制品注射劑，在臨床使用前，需要充分考慮該制品注射后血管刺激性和溶血性等安全性指標。本研究依據《藥品注冊管理辦法》和《藥物刺激性、過敏性和溶血性研究技術指導原則》開展新西蘭兔血管刺激性試驗和體外溶血性試驗[3-4]，以評價公司自制人凝血因子Ⅷ產品的非臨床安全性。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

人凝血因子Ⅷ為自制樣品（200 IU/ 瓶，復溶后體積為10 mL/瓶）；滅菌注射用水（批號：1404043202），石家莊四藥有限公司；氯化鈉注射液（批號：D13101501-2），廣東科倫藥業有限公司。

SB32000 電子天平，瑞士METTLER TOLEDO 公司；TP1020 脫水機、EG1160 石蠟包埋機、RM2155切片機、DM5000B 生物熒光顯微鏡，德國Leica 公司；RWD200 微量注射泵，深圳市瑞沃德生命科技有限公司；5840R 臺式高速低溫離心機，德國Eppendorf Centrifuge 公司；PYX-DHS-4050 隔水式電熱恒溫培養箱，上海躍進醫療器械有限公司；EOS 600D 數碼相機，日本佳能公司。

1.2 實驗動物

普通級新西蘭兔，2.0 ～2.5 kg，9 只（雌性5只，雄性4 只），血管刺激性試驗使用8 只（雌雄各半），體外溶血試驗使用1 只（雌性）。來源于廣東省醫學實驗動物中心（三水基地），實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2014-0035，實驗動物質量合格證號44411600000443。

1.3 血管刺激性試驗

參考文獻[5-6]開展血管刺激性試驗。本試驗用8 只動物（編號V1 ～V8），均為受試物組，采用自身左右側對照。動物在給藥前進行稱重、分組，根據分組當天測定的體重，通過隨機數表進行分組。人凝血因子Ⅷ臨床最大使用劑量為40 IU/kg，按照所提供的供試品規格和濃度計算，新西蘭兔的給藥量為6 mL/kg（按體表面積折算，劑量為人臨床最大等效劑量）[7]。

使用恒速微量注射泵于新西蘭兔耳緣靜脈注射給藥，注射器與針頭之間連接過濾裝置。采用自身對照，給藥前新西蘭兔耳緣靜脈給藥部位去毛，于左耳耳緣靜脈緩慢注射給予人凝血因子Ⅷ溶液，右耳耳緣靜脈給予等體積的0.9%氯化鈉注射液。每天1 次，連續8 d。

給藥過程中，試驗操作人員需要將給藥速度控制在1 ～2 mL/min，并注意動物的保定及針頭的固定，防止藥液滲出。每天給藥前、后及停藥后觀察動物的一般狀態、行為、體征以及注射部位反應，末次給藥后72 h、14 d 分別取4 只動物解剖，進行病理制片和組織病理學檢查。

病理學檢查：末次給藥72 h 后取4 只（V1、V3、V5、V7）新西蘭兔麻醉后頸動脈放血安樂死，肉眼觀察記錄血管組織的反應后，從耳根部切除雙兔耳，進行常規石蠟制片，然后進行組織病理學檢查。其余動物（V2、V4、V6、V8）繼續觀察，于末次給藥后14 d再進行組織病理學檢查，以了解刺激性反應的可逆程度。病理評分標準見表1。

表1 血管刺激性光鏡檢查評分及結果判定標準

1.4 溶血性試驗

參考文獻[5-6]開展溶血性試驗。取兔血10 mL，放入含玻璃珠的三角燒瓶中振搖10 min，除去纖維蛋白原。取脫纖血液加10 倍量的等滲溶液（生理鹽水），輕輕搖勻，1 500 r/min 離心10 min，除去上清液，每管加約沉淀10 倍量的0.9%氯化鈉溶液搖勻，按上述方法洗滌3 次，至上清液不顯紅色為止。將所得紅細胞用0.9%氯化鈉溶液配成2%的混懸液，供試驗用。

如表2 所示，取潔凈試管7 支，進行編號，1 ～5號管為受試物（人凝血因子Ⅷ）管，6 號為陰性對照管，7 號管為陽性對照管。按表所示依次加入2%紅細胞懸液、0.9%氯化鈉溶液或滅菌注射用水和藥液，混勻。置37 ℃恒溫箱中溫育3 h，于15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h 觀察，判斷紅細胞溶解和凝集情況。

表2 溶血試驗加樣表（單位：mL）

2 結果與分析

2.1 新西蘭兔刺激性試驗

給藥期間和停藥期間，動物的一般觀察未見明顯異常。給藥期間，1 號動物左右側和7 號動物右側注射部位呈暗紅色，質地稍硬，其余動物注射部位觀察未見明顯異常。結合組織病理學檢查（圖1 和圖2）及評分結果（表3），末次給藥后72 h 和14 d，人凝血因子Ⅷ對新西蘭兔耳緣靜脈無刺激。

圖1 血管刺激性試驗末次給藥后72 h 顯微鏡下觀察結果（HE×100）

圖2 血管刺激性試驗末次給藥后14 d 顯微鏡下觀察結果（HE×100）

表3 人凝血因子Ⅷ對新西蘭兔血管刺激性反應評分結果及評價

2.2 體外溶血試驗

自加藥后15 min 開始至3 h 觀察結束時，陽性對照管上部見澄明紅色，陰性對照管、人凝血因子Ⅷ（加藥濃度為20 IU/mL）各稀釋管上層液體均見無色澄明。因此陽性對照溶血反應為陽性，陰性對照和人凝血因子Ⅷ的各稀釋度藥液溶血反應均為陰性，見圖3。

圖3 溶血性試驗結果

3 結論與討論

人凝血因子Ⅷ系由徤康人血漿經分離、提純，并通過S/D 法［0.3%磷酸三丁酯和1%聚山梨酯80 于（25±1）℃作用6 h]和干熱法（99 ～100 ℃作用30 min）處理后，再經凍干制成的血漿蛋白制品[8]。F Ⅷ制品制備過程中，采用S/D 法進行病毒滅活，造成成品中還有微量的聚山梨酯80 殘留，已有文獻報道聚山梨酯作為增溶性藥用輔料引起不良反應，普遍認為其存在溶血性[9]。F Ⅷ產品在長期臨床實踐中被證實是安全的[10]，但因F Ⅷ需經注射給藥，不同廠家制備工藝不同，產品成分存在差異，故有必要對本公司F Ⅷ自制產品開展相關非臨床安全研究。

人凝血因子Ⅷ臨床上主要用于防治甲型血友病和獲得性凝血因子Ⅷ缺乏而致的出血癥狀及這類病人的手術出血治療。臨床給藥途徑為靜脈注射，本研究為檢測其刺激性和溶血性，進行新西蘭兔血管刺激性試驗和體外溶血試驗。結果顯示，人凝血因子Ⅷ對新西蘭兔靜脈注射給藥，每天1 次，連續8 d，末次給藥后72 h 和14 d，人凝血因子Ⅷ對新西蘭兔耳緣靜脈無刺激。人凝血因子Ⅷ體外對兔紅細胞未見溶血作用，不引起紅細胞凝聚。因此，本公司自制的人凝血因子Ⅷ不具有血管刺激性和溶血性，本研究的開展為產品的臨床研究及應用奠定了基礎。