鳳仙花提取物對灰指甲主要致病菌的抑制作用

劉夢雅，羅林焱，孫志彬，胡曉倩，李有鵬，胡煥煥，姬國杰

（1.新鄉醫學院三全學院 生命科學技術學院，河南新鄉 453000；2.新鄉醫學院三全學院 干細胞研究院，河南新鄉 453000；3.新鄉醫學院三全學院 生物與基礎醫學實驗教學中心，河南新鄉 453000）

甲真菌病是指（趾）甲的真菌病，導致患者指甲板變色和增厚，是全世界最常見的指（趾）甲感染。引起灰指甲的致病菌主要有白色念珠菌和紅色毛癬菌等。白色念珠菌是定植于人體皮膚表面及開放性腔道（口腔、消化道及泌尿生殖道）的共生菌群，在一定條件下可引起局部上皮甚至全身感染[1-2]。紅色毛癬菌是一種常見的親人性致病性皮膚癬菌[3]，有研究指出皮膚癬菌病中90%的慢性感染都由其所致[4]。目前，針對甲真菌病的治療方法主要有口服抗真菌藥物、局部藥物和激光等，但口服抗真菌藥物副作用較大[5]；依非那康唑、塔瓦博洛等局部治療藥物治愈率普遍較低，治療周期長；激光有助于改善指（趾）甲外觀。同時，由于治療的研究方法和定義的高度變化性，以上方法對甲真菌病的有效性尚未得到充分證明[6]。因此，迫切需要高效、副作用低的新型藥物。

中草藥已成為開發抗真菌藥物的一個重要材料[7-9]。鳳仙花不僅是觀賞花卉，而且還是一種中草藥[10]。我國中醫學研究表明，鳳仙花在抑制真菌方面有較好的效果，可以抗感染、鎮痛、抗炎等[11]，也經常被用于治療蛇咬傷、鵝掌風、癰癤瘡疔、灰指甲等病癥[12]，化學成分主要有黃酮、萘醌、花青素等[13]。目前，國內外主要研究鳳仙花的化學成分，其中萘醌類具有明顯的抑菌活性[14]，但其抑菌機制不詳，同時也缺少對鳳仙花資源的開發與應用。

鳳仙花對白色念珠菌和紅色毛癬菌治療療效顯著，因其價格低廉、來源廣泛等優點，在臨床上具有一定的研究價值。本文首先對鳳仙花的有效成分進行提取和富集，并探討其體外抑菌活性，在此基礎上對抑菌機制進行初步研究，為開發新型中藥抑菌藥物提供理論基礎，同時為治療灰指甲等皮膚疾病提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LS-75HJ 立式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫療設備有限公司；TS-300DC 恒溫搖床，上海天呈實驗儀器制造有限公司；SW-CJ-2F 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；U/V110Pro紫外可見分光光度計，翱藝儀器（上海）有限公司；JY10002 電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；GT16-3 高速臺式離心機，北京新時代北利醫療器械有限公司；DHP-600 電熱恒溫培養箱，北京市永光明醫療儀器有限公司。

重瓣鳳仙花（ImpatiensbalsaminaL.）采集于河南省開封市；堿性磷酸酶（AKP）試劑盒、馬鈴薯葡萄糖瓊脂營養培養基（PDA）、酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基（YPD），北京索萊寶科技有限公司；伊曲康唑，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；95%乙醇，國藥集團化學試劑有限公司；二甲基亞砜（DMSO），天津市德恩化學試劑有限公司；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司。

白色念珠菌（GDMCC3.629）、紅色毛癬菌（ATCC MYA4438），廣東微生物菌種保藏中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 鳳仙花醇提取液的制備

參照董晨虹[15]的方法并加以改進。稱取鳳仙花的莖、葉、花各1.5 g，用研缽碾碎，加入200 mL 55%乙醇，置于索氏提取器中70 ℃抽提2 h，按上述條件重復提取1 次，真空抽濾，得到澄清的提取液，60 ℃減壓濃縮至4.5 mL，得到鳳仙花濃縮液（1 g/mL），0.22 μm 針頭濾器過濾，放入冰箱冷藏，備用。

1.2.2 陽性對照的制備

稱取2.5 mg 伊曲康唑粉劑溶于177 μL DMSO 溶液中，配置成濃度為20 mmol/L 儲備液，取10 μL 儲備液，用4 990 μL 無菌水稀釋為40 μmol/L 工作液，將儲備液與工作液密封，于-20 ℃避光保存[16]。

1.2.3 菌懸液的制備

將白色念珠菌、紅色毛癬菌凍干粉全部溶解，分別轉移至YPD、PDA 固體培養基上，白色念珠菌在28 ℃培養箱中培養2 d，紅色毛癬菌在30 ℃培養箱中培養7 d，連續接種傳代兩次恢復活力。將已活化的菌株轉移至液體培養基中按上述溫度、150 r/min 振蕩培養，使菌懸液的濃度達到2×106CFU/mL，備用[17]。

1.2.4 生長動力學曲線的測定

（1）白色念珠菌生長動力學曲線的測定

參考董潔潔[18]的方法并加以改進。白色念珠菌接種至100 mL YPD 液體培養基中，于150 r/min、28 ℃培養箱中培養12 h。將2 mL 菌懸液接種于200 mL液體YPD 培養基中振蕩培養，分別在0 ～14 h 和26 ～36 h 每隔2 h 測定菌懸液在530 nm 的吸光度OD530，分別以時間、OD值為橫、縱坐標，繪制白色念珠菌生長動力學曲線圖。

（2）紅色毛癬菌生長動力學曲線的測定

參考鮑迎秋等[19]的方法，將已接種紅色毛癬菌的PDA 固體培養基于30 ℃條件下培養2 周，用解剖顯微鏡觀察菌落形態并用游標卡尺測量記錄菌落直徑，分別以生長時間、菌落平均直徑為橫、縱坐標繪成紅色毛癬菌生長動力學曲線。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定

測定白色念珠菌的MIC，用醇提法得到濃度為0.5 g/mL 的鳳仙花提取液母液，用二倍稀釋法進行稀釋，得到質量濃度分別為0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL、0.062 5 g/mL 的提取液；測定紅色毛癬菌的MIC，用相同方法得到濃度為1 g/mL 的鳳仙花提取液母液，用二倍稀釋法進行稀釋，得到質量濃度分別為1.000 00 g/mL、0.500 00 g/mL、0.250 00 g/mL、0.125 00 g/mL、0.062 50 g/mL、0.031 25 g/mL、0.015 60 g/mL的提取液。

在超凈工作臺內，將無菌牛津杯放入培養皿，待培養基凝固后取出牛津杯及里面的培養基，形成一圓柱形小孔，分別取白色念珠菌、紅色毛癬菌菌懸液200 μL 在固體瓊脂平板上均勻涂布，在牛津杯孔內分別加入100 μL 不同濃度的鳳仙花稀釋液，伊曲康唑工作液為陽性對照組，無菌水為陰性對照組，每個濃度做3 個重復處理。最后將白色念珠菌置于28 ℃條件下培養24 h，紅色毛癬菌置于30 ℃條件下培養5 d，抑菌圈邊緣處的鳳仙花提取液的濃度可視為其對指示菌的最低抑菌濃度（MIC），即能產生透明抑菌圈的最低抑菌劑濃度定為MIC。觀察抑菌圈大小，拍照并用游標卡尺測量其直徑大小，取平均值。

1.2.6 鳳仙花醇提取液對兩種菌細胞壁的影響

參照堿性磷酸酶試劑盒說明書及董潔潔[18]的方法并加以改進。50 mL 液體YPD、PDA 培養基中接種白色念珠菌（紅色毛癬菌），在28 ℃（30 ℃）培養箱中150 r/min 培養12 h（7 d）作為預備菌懸液，在預備菌懸液中加入最低抑菌濃度的鳳仙花醇提取液。在白色念珠菌生長0 h、2 h、4 h、6 h 和8 h 時取樣，紅色毛癬菌生長0 d、1.0 d、1.5 d、2.0 d、2.5 d、3.0 d、4.0 d、5.0 d、6.0 d 和7.0 d 時取樣，10 000 r/min 離心取上清，即為待測樣品，測定標準管、空白管、測定管、對照管在510 nm 處的OD510值，按照公式（1）計算AKP 活性（U/mL）。

1.2.7 統計學分析

使用GraphPad Prism 8.0 統計軟件進行統計學處理，抑菌圈直徑以均值±標準差表示，抑菌圈直徑組間比較采用單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 生長動力學曲線

2.1.1 白色念珠菌生長動力學曲線

如圖1 所示，白色念珠菌在接種后至4 ～12 h 處于對數生長期，生長速度較快，在12 ～18 h 處于穩定期，隨后進入衰退期。

圖1 白色念珠菌生長動力學曲線

2.1.2 紅色毛癬菌生長動力學曲線

如圖2 所示，紅色毛癬菌3 ～12 d 處于對數生長期，生長速度較快，12 d 后進入穩定期。

圖2 紅色毛癬菌生長動力學曲線

2.2 鳳仙花醇提取液對兩種菌的抑制作用

由圖3 和圖4 可知，與陰性對照相比，鳳仙花醇提取液的濃度為0.500 0 g/mL、0.250 0 g/mL、0.125 0 g/mL時，抑菌圈直徑較大，說明此濃度對白色念珠菌有明顯抑制作用（P＜0.05），且具濃度依賴性；0.062 5 g/mL鳳仙花醇提取液對白色念珠菌的抑制效果無顯著性差異（P＞0.05），即無抑制作用，抑菌圈直徑為0。由此可知最小抑菌濃度是0.125 0 g/mL。與陽性對照相比，鳳仙花提取液濃度為0.500 0 g/mL 時，抑菌效果顯著提高（P＜0.05）。

圖3 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對白色念珠菌抑制效果

圖4 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對白色念珠菌的抑菌圈

由圖5 和圖6 可知，鳳仙花醇提取液的濃度為不低于0.250 00 g/mL 時，平板上沒有菌落出現，說明此濃度對紅色毛癬菌完全抑制。與陰性對照相比，0.031 25 g/mL、0.062 50 g/mL、0.125 00 g/mL 鳳仙花提取液對紅色毛癬菌有顯著的抑制作用（P＜0.05），且具有濃度依賴性；0.015 60 g/mL 鳳仙花提取液無顯著抑制作用（P＞0.05）。由此可知鳳仙花醇提取液對紅色毛癬菌的最低抑菌濃度為0.031 25 g/mL。與陽性對照相比，鳳仙花醇提取液濃度大于0.062 50 g/mL時，具有顯著抑菌效果（P＜0.05）。

圖5 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對紅色毛癬菌抑制效果

圖6 不同濃度梯度鳳仙花醇提取液對紅色毛癬菌的抑菌圈

綜上可知，在一定濃度范圍內，隨著提取液濃度的增加，抑菌圈直徑在增加，說明抑制作用在不斷增強。鳳仙花醇提取液對兩種供試菌都有明顯的抑制作用，對紅色毛癬菌的抑制效果較白色念珠菌更顯著，可知不同真菌對同一鳳仙花醇提取液的敏感程度也不同。

2.3 鳳仙花醇提取液對兩種菌細胞壁的影響

如圖7 所示，在0 ～2 h 時，白色念珠菌菌懸液上清在510 nm 下的吸光度增加速率較慢，表明由于作用時間較短，鳳仙花醇提取液未對白色念珠菌細胞壁產生明顯破壞作用；在2 ～8 h 內吸光度增加速率明顯提升，表明可以在菌體體外檢測到AKP 活性，證明鳳仙花醇提取液影響了菌體細胞壁的通透性。

圖7 鳳仙花提取物對白色念珠菌細胞壁的影響

如圖8 所示，在0 ～2.5 d 內，紅色毛癬菌菌懸液上清在510 nm 下的吸光度增加速率較快，隨后吸光度基本保持穩定，表明可以在菌體外部檢測到AKP活性，證明鳳仙花醇提取液影響了菌體細胞壁的通透性。

圖8 鳳仙花提取物對紅色毛癬菌細胞壁的影響

3 結論與討論

用牛津杯法對鳳仙花醇提取液的抑菌效果進行研究，結果表明，鳳仙花醇提取液對白色念珠菌和紅色毛癬菌具有良好的抑制效果，且濃度越高，抑制效果越顯著，最小抑菌濃度分別為0.125 0 g/mL、0.031 25 g/mL，對紅色毛癬菌的抑制效果更顯著。通過本文的抑菌機制實驗，表明鳳仙花提取物通過破壞真菌的細胞壁完整性，改變細胞壁的通透性抑制真菌的活性，與文獻結果一致[20-21]。因此，研究植物提取物的抗菌潛力和實際無毒性表明，通過對植物的進一步研究，利用其開發抗菌藥物是可行的[22]。

與其他植物的臨床應用數據相比，鳳仙花的活血、止痛等作用機制和相應的物質基礎，以及其他部位如根和種子的研究較少，因此仍有大量關于鳳仙花不同藥用部位的研究工作需要開展[23]。降低抗真菌藥物毒副作用、改善耐藥性和開發廣譜、耐藥、有效的新藥物是抗真菌藥物研究的主題[23]。本實驗為研究中草藥新型抗菌藥物提供了理論支持，因樣本來源單一，抑菌機理研究還不夠完整，本實驗研究有一定的局限性。