pH 和pCO2 對抗體五聚甘露糖修飾水平的影響研究

陳孝歡，孫瑞強

（1.復旦大學 生命科學學院，上海 200438；2.上海藥明生物技術有限公司，上海 200131）

目前，生物制藥領域的主流藥物類型仍然是重組抗體類蛋白藥物，該類藥物的糖基化修飾對藥效有重要影響，由于N-型糖基化修飾中的五聚甘露糖（Man 5）能與人體細胞中的甘露糖受體結合，可以顯著加速抗體類蛋白藥物在人體中的清除速率。人體內源性抗體的高聚甘露糖含量極少（＜0.1%）[1]，而通過中國倉鼠卵巢細胞（CHO）表達的重組抗體的高聚甘露糖比例更高，通常在1%～20%[2]。細胞培養過程中許多工藝參數均會影響目的蛋白的Man 5 修飾比例，例如培養基、添加物、溫度、滲透壓和pH等[3]。其中關于pH 對Man 5 修飾水平影響的研究中，極端pH 條件（pH ＜6.5 或pH ＞7.5）均會影響高爾基體功能，從而使Man 5 修飾水平大大提高[4]。而在常規pH 培養范圍內，有學者觀察到高pH 有利于降低Man 5 比例[5]；也有學者提出，不同細胞系下，pH 對Man 5 的影響作用存在差異[6]。由于哺乳動物細胞培養常使用CO2氣體降低培養體系中的pH，所以低pH 條件下通常還伴隨高pCO2的情況，在未詳細探究pCO2對Man 5 影響的情況下，將Man 5 水平變化的原因歸結為pH 稍顯片面，有可能忽略真實原因。

本文使用鹽酸和CO2對pH 和pCO2分別進行控制，并通過完全析因實驗設計方法（簡稱全因子設計，cfDoE），研究了胞外pH（pHe）和pCO2與Man 5修飾水平的關系[pH 的研究水平分別為6.85±0.05 和7.35±0.05，pCO2的研究水平分別為（30±10） mmHg和（130±10） mmHg]，通過胞內pH（pHi）檢測、細胞周期檢測和關鍵糖苷酶轉錄水平檢測初步探究了在工藝條件影響下，Man 5 水平發生變化的潛在內因。

1 材料與方法

1.1 細胞株

本文所用細胞株為重組了Fc 端融合蛋白基因的單克隆，由上海藥明生物技術有限公司細胞株構建部使用CHO-K1 宿主轉染構建而成，可正常生長和表達目的蛋白。

1.2 試劑與儀器

培養所用培養基均為化學限定培養基。基礎培養基CD CHO，美國Introgen 公司；基礎培養基ActiPro以及補料培養基Cell Boost 7a 和Cell Boost 7b，美國Cytiva 公司；pH 指示劑pHrodo Green AM Intracellular，美國Thermo Fisher 公司；碘化丙啶/核糖核酸酶染色緩沖液PI/RNase Staining Buffer，美國BD 公司；pCO2電極，美國Metteler Toledo 公司；3 L 玻璃生物反應器，荷蘭Applikon 公司；生物反應器控制器，美國Thermo Fisher 公司；Vi-CELL XR 細胞計數儀，美國Beckman公司；Cedex Bio HT 生化分析儀，瑞士Roche 公司；BGA 348EX 血氣分析儀，美國Siemens 公司；Accuri C6 流式分析儀，美國BD 公司；ISF1-X CO2搖床，瑞士Kuhner 公司。

1.3 種子細胞培養

從液氮罐中取出凍存細胞后，放置在37 ℃水浴2 min 復蘇，接種至裝有CD CHO 培養基的搖瓶中，置于36.5 ℃、6% CO2的搖床中120 r/min 懸浮培養。之后每3 天傳一次代，傳代初始密度為0.20×106cells/mL。

1.4 批次補料培養

將種子細胞以0.4×106cells/mL 接種至3 L 玻璃生物反應器中，初始培養體積為1 500 mL，攪拌轉速為250 r/min， 初始培養溫度為36.5 ℃，培養第5 d 降溫至31 ℃；初始培養pH 為7.0±0.2，第6 d 更改pH設置，開啟pCO2控制，詳細控制方案如表1 所示。溶氧設置目標值為40%，在培養第3 d、5 d、7 d、10 d分別進行補料，CB7a 補料體積為45 mL，CB7b 補料體積為4.5 mL。

表1 pHe 和pCO2 控制方案

1.5 細胞培養日常參數檢測

每日取樣3 mL 進行日常參數檢測，檢測內容包括細胞計數檢測活細胞密度和細胞活率，血氣分析儀檢測離線pH 和pCO2，生化分析儀檢測葡萄糖濃度和乳酸濃度。

1.6 抗體表達量和糖基化分析

抗體表達量由生化分析儀檢測完成；糖型分析由上海藥明生物技術有限公司分析科學部支持，使用高效液相方法完成。

1.7 pHi 檢測

對批次補料培養第8 d、10 d、12 d 和收獲日（14 d）的細胞進行pHi檢測（檢測時間代號分別為D8、D10、D12、D14），依據pHrodo Green AM Intracellualr pH 試劑的protocol 染色孵育后，使用流式細胞儀進行熒光強度分析，激發波長為488 nm，接收波長為533 nm。熒光強度越高代表pHi值越低。

1.8 細胞周期檢測

對批次補料培養收獲日的細胞進行細胞周期檢測，使用PI/RNase Staining Buffer 避光染色孵育15 min后，使用流式細胞儀進行染色分析，以低流速進樣20 000 events, 在PE-A/count 中標取不同周期階段的細胞組群，單倍體峰為G0/G1 期，中間過渡區為S 期，二倍體峰為G2/M 期，并統計各期細胞的比例。

1.9 GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉錄水平檢測

將批次補料培養收獲日細胞液300×g 離心5 min，收集細胞，-80 ℃凍存。由上海藥明生物技術有限公司蛋白質科學部支持，對GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnTⅡ三種糖苷酶進行RT-RNA 檢測。

1.10 cfDoE 方案與結果分析方法

使用Minitab軟件設計兩因子兩水平的全析因實驗，pHe的高低水平分別為7.35±0.05 和6.85±0.05，pCO2的高低水平分別為（130±10） mmHg和（30±10） mmHg，中心點重復兩次，詳細實驗方案如表1。實驗完成后依次將Man 5 比例、G0/G1 期細胞比例、GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種糖苷酶轉錄水平作為響應變量進行統計分析，以P＜0.05 為顯著性判斷標準，識別pHe、pCO2和pHe*pCO2交互作用對各響應變量影響的顯著性。

2 結果與分析

2.1 細胞生長結果

本實驗的pH 和pCO2控制曲線如圖1（A）和圖1（B），從6 d 開始設置cfDoE 控制條件后，pH 和pCO2基本維持在目標范圍。細胞生長結果如圖1（C）和圖1（D），各實驗條件的活細胞密度曲線基本可比，而細胞活率存在差異，其中低低水平組合（BR 1）的細胞活率下降最明顯，高高水平組合（BR 4）的細胞活率維持最高。本實驗的代謝結果如圖1（E），高高組合在7 ～9 d 乳酸濃度最高，隨后緩慢消耗。總體來看，高pCO2條件下有明顯后期堆積乳酸的趨勢，是一個不穩定因素，而低pH 條件可以更好地穩定乳酸代謝表現。

圖1 細胞培養結果

2.2 蛋白產量結果

本實驗蛋白產量結果如圖2，從培養4 d 開始，發酵液中有少量產物蛋白產生，8 ～12 d 為產量快速增長時期，由此提示，外界環境對產物蛋白產生影響的關鍵時期為培養6 d 后，進一步佐證了批次補料培養中將影響Man 5 的條件設置在降溫后的合理性。

圖2 蛋白產量結果

本實驗目的蛋白產量的析因分析P值匯總如表2，從P值來看，各條件對蛋白產量無顯著性影響，因子效應圖不再展示。此結果充分說明析因結果中的響應效應是由實驗設計因子引起，而非因子條件下蛋白產量降低所引起。

表2 蛋白產量析因分析P 值匯總

2.3 pHe 和pCO2 對Man 5 水平影響的析因分析

pHe和pCO2對Man 5 水平影響的主效應和交互效應如圖3 和圖4 所示，對應的效應P值如表3 所示。從析因分析結果來看，從培養8 d 開始，pCO2即對Man 5 有顯著性負效應，該效應一直維持至培養結束；pCO2對Man 5 產生顯著性影響的時間早，影響效果最顯著，是降低Man 5 修飾比例的關鍵因子。而pH 對Man 5 比例產生影響的時間較晚，從12 d 才開始表現正效應，影響效果相對輕微。兩者的交互作用也是從12 d 開始產生，呈微弱反向交互作用；在低pCO2情況下，pH 越低Man 5 修飾比例越低；在高pCO2情況下，pH 越高Man 5 修飾比例越低。

圖3 cfDoE 實驗設計主效應圖

圖4 cfDoE 實驗設計交互效應圖

表3 cfDoE 實驗Man 5 比例P 值匯總

2.4 pHi 檢測結果

本實驗的pHi檢測結果如圖5 所示，由于實驗數據較多，為方便比較，以中位熒光值代表pHi強度，采用熱圖對數據進行分析，顏色越深代表中位熒光值越高，pHi越低；顏色越淺代表中位熒光值越低，pHi越高。

圖5 cfDoE 實驗pHi 檢測結果

從結果來看，條件添加后的pHi隨時間變化而變化，且與培養條件有一定相關性：在條件添加早期（培養8 d），pCO2越高，pHi酸化越明顯；但是隨著培養時間增加，pHi逐漸堿化，且初始酸化越明顯的條件，堿化越迅速，堿化強度也越大；而低pCO2組在條件添加早期酸化并不明顯，但是隨著培養時間增加，pHi逐步酸化。這一現象與高pCO2降低Man 5 比例效應時間早、效果強，而HCl 控制的低pH 降低Man 5 比例的效應時間晚、效果相對較弱有一定對應關系。

以上現象說明高pCO2和低pH 兩個因素均能酸化胞內pH，兩者的作用方式存在差異：（1）無論pH高低，由于CO2的可透膜性，高pCO2條件均可快速酸化生物膜內環境，胞質pH 在被酸化后，細胞啟動內環境調節系統，從而呈現了后期的堿化現象；（2）而低pCO2下的低pH 條件可能是由于細胞長期處于低pH 環境中，緩慢滲透適應，使得胞內pH 逐步降低。由此猜測，以上兩種酸化方式導致胞內不同細胞器所處的環境有所差異，從而表現出不同的代謝和糖基化現象。在高pCO2條件下，大量的CO2不僅可以跨過細胞膜，還可以穿透細胞器膜[7]，從而影響各細胞器的功能，線粒體因為過度酸化而功能受損，乳酸代謝因此異常，而高爾基體和內質網的功能由于酸化環境得到保護和維持，有利于蛋白的翻譯后修飾，Man 5比例因此而降低；而在低pCO2低pHe條件下，通過細胞膜上離子通道對H+的轉運調節僅能影響胞質pH，其他細胞器不易受到影響，所以該條件下的細胞代謝穩定，Man 5 修飾水平降低不明顯。

由此可見，pHi越早酸化，且酸化程度高時，糖蛋白從被表達開始就能被充分糖基化修飾，Man 5 修飾水平則可以維持在較低水平。

2.5 細胞周期檢測結果

培養結束時G0/G1 期細胞比例的因子效應圖如圖6 所示，pHe的影響P值為0.086，pCO2的影響P值為0.046，此時G0/G1 期細胞比例與pCO2水平有明顯正相關性，即pCO2水平越高，G0/G1 期細胞比例越高。當細胞處于不同的周期時，其生命活動形式有所差異，G0/G1 期的細胞為下一次分裂繁殖做準備，會大量合成蛋白質，產物蛋白也在這一時期被表達修飾，當G0/G1 期細胞占比更大時，說明承擔蛋白質表達修飾的載體工具較多，蛋白翻譯后修飾越充分，這也許也是高pCO2條件下Man 5 比例低的原因之一。

圖6 cfDoE 實驗G0/G1 期細胞比例效應圖

2.6 關鍵糖苷酶轉錄水平檢測結果

培養結束時GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ三種酶轉錄水平的因子效應圖如圖7 所示。pHe對以上三者的影響P值分別為0.745、0.557 和0.827，pCO2對以上三者的影響P值分別為0.402、0.323 和0.202，說明pHe和pCO2對三種糖苷酶轉錄水平無顯著性影響，由此可見各條件未對細胞的糖苷酶表達量水平產生實際影響，Man 5 水平的改變更有可能是高爾基體中糖苷酶所處pH 環境改變后，酶活性改變引起的。這也側面印證了pHi是影響糖基化修飾水平的關鍵因素。

圖7 cfDoE 實驗糖苷酶轉錄水平主效應圖

2.7 討論

兩因素兩水平的析因實驗結果確定了降低Man 5修飾比例的主要因素是高pCO2，pHe以及pHe和pCO2的交互作用為次要因素。主因子和交互因子對蛋白產量均無統計學意義上的顯著性影響，可以排除蛋白產量對Man 5 比例的影響，進一步確認了因子效應的有效性。在乳酸代謝方面，僅低pCO2低pHe條件有穩定的代謝表現，所有高pCO2條件均有乳酸代謝異常的風險，而中心點水平的pCO2（80 mmHg）乳酸代謝正常，這為高pCO2應用在降Man 5 時的參數范圍提供參考。在降低Man 5 比例的機理研究方面，pHi和G0/G1期細胞比例均與效應因子呈一定相關性，其中高pCO2降低Man 5 的主要原因可能有兩方面：（1）可能是由于大量CO2快速透膜酸化胞質pH 環境，穩定了內質網-高爾基體的低pH 狀態，為糖基化修飾提供了安全穩定的場所；（2）可能是由于高pCO2環境下，G0/G1 期細胞比例上升，糖基化修飾場所增加，糖蛋白的糖基修飾更充分。此外，研究條件下三個糖苷酶轉錄水平在效應因子作用下無顯著性變化。

綜合來看，高pCO2是降低Man 5 的關鍵因素，也是引起細胞培養乳酸代謝異常的風險因素，低pHe一定程度上也能降低Man 5 比例，雖然效果不及高pCO2，但是能很好地控制乳酸代謝，穩定細胞培養表現。

3 結論

對于培養pH 影響Man 5 修飾水平方面，前人的研究僅停留在pH 一個方面，忽略了pH 變化所引起的pCO2改變對Man 5 的影響，從而有相互沖突的研究結論，對降低Man 5 修飾水平的工藝策略制定存在一定誤導性。本研究對培養pH 和培養pCO2進行分別控制，通過全因子設計的研究方法，全面評估了pH（6.85 ～7.35）和pCO2（30 ～130 mmHg）對Man 5 的影響，確認了影響Man 5 修飾水平的主要因素是pCO2；同時，pHi、G0/G1 期細胞比例和GnT Ⅰ、α-Man Ⅱ和GnT Ⅱ酶轉錄水平檢測結果進一步揭示了pCO2引起Man 5 水平變化的真相。本研究為降低Man 5 修飾水平提供了新的思路，也加深了細胞培養工藝參數對抗體Man 5 修飾水平影響的認識。