喹諾酮信號分子對lasR 缺陷型銅綠假單胞菌綠膿菌素活性的影響

王延茹，段金菊

（1.山西醫科大學汾陽學院 基礎醫學部藥理教研室，山西汾陽 032200；2.山西醫科大學第二醫院 藥學部，山西太原 030001）

銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa，PA）廣泛存在于自然界，是臨床分離率高且耐藥性強的條件致病菌[1-3]。綠膿菌素是PA 分泌的一種藍綠色吩嗪類次級代謝產物，不僅能自由地穿透生物膜、干擾正常離子轉運、打斷細胞呼吸鏈、過量產生氧自由基導致細胞死亡，還參與細菌外排泵的激活[4-5]，因此，綠膿菌素在PA 定植、感染以及耐藥的發生發展過程中發揮著重要的作用。綠膿菌素受多種調控信號網絡介導[6]，研究較為成熟的是群體感應（Quorum Sensing，QS）系統，該系統參與綠膿菌素在內的多種毒力因子的調控[7-10]。喹諾酮信號分子（Pseudomonas Quinolone Signal，PQS）是QS 系統中至關重要的信號分子[11-12]，由于在慢性感染人群（如囊性纖維化患者）的臨床標本中經常發現lasR缺陷突變菌[2,13]，該菌不產生或產生極少量的內源性PQS[2,7]，卻能增強綠膿菌素的表達[13]。本研究選取臨床分離lasR 缺陷菌株與正常菌株為研究對象，對比探究PQS 不同誘導方案對兩種菌株綠膿菌素活性的影響，旨在進一步了解PQS對銅綠假單胞菌致病性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

收集2021 年3 月至2022 年10 月山西醫科大學第二醫院經全自動鑒定儀VITEK-2 鑒定的銅綠假單胞菌作為研究對象。正常組納入標準：由臨床血培養及胸水腹水等無菌體液分離得到；非重復菌株；QS基因正常。排除標準：經PCR 擴增及DNA 測序檢測QS 基因lasR、rhlR、lasI、rhlI以及pqsR單一或多種基因缺失[14]。只有lasR基因缺失菌株為缺陷組。質控菌株為銅綠假單胞菌ATCC 15692（PAO1），為南開大學生命科學學院分子微生物學與微生物工程實驗室惠贈。收集到的正常菌株和lasR缺陷菌株作為本研究的原始菌株。

1.1.2 試劑與儀器

PQS，HPLC 級，批號BCBR3314V，美國Sigma-Aldrich 公司；0.9%氯化鈉注射液，醫用級，石家莊四藥有限公司；氯仿，分析純，北京化工廠有限責任公司；鹽酸，分析純，深圳市精成科技有限公司；血培養皿，濟南百博生物技術股份有限公司；綠膿菌素測定用培養基，批號210322，北京陸橋技術有限責任公司；一次性使用培養皿，江蘇康健醫療用品有限公司；LB 液體培養基，北京陸橋技術有限責任公司。

SpectraMax 190 全波長酶標儀，上海美谷分子儀器有限公司；BY-R20 型低溫高速離心機，北京白洋醫療器械有限公司；GNP-9270BS-Ⅲ隔水式恒溫培養箱，上海新苗醫療器械制造有限公司；LMQ.C 型立式高壓滅菌鍋，山東新華醫療器械股份有限公司；21255 麥氏比濁儀，生物梅里埃公司；Costar-3599 型96 孔板，美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 PQS 誘導方案

（1）復蘇菌株：將保存于-70 ℃的原始菌株接種于血培養皿，37 ℃恒溫過夜培養；（2）配制含PQS培養基：分別配制10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L的含PQS 固體培養基；（3）傳代培養：將純化的銅綠假單胞菌用無菌0.9%NaCl 調成3.0 麥氏單位，取菌液20 μL 接種于上述含藥培養基中，恒溫培養24 h后作為誘導一天的菌株；將誘導一天菌株用無菌0.9%NaCl 調成3.0 麥氏單位，取菌液20 μL 接種于上述含PQS 新培養基中繼續恒溫培養24 h 作為誘導第二天的菌株；以此類推，分別誘導至第五天，將完成誘導的菌株分別在-70 ℃保存于液體培養基中。

1.2.2 綠膿菌素活性的測定

（1）綠膿菌素測定用培養基的配制：按每100 mL蒸餾水中含4.64 g 綠膿菌素測定用培養基、1 g 甘油的比例進行配制，充分搖勻，以121 ℃高壓滅菌20 min，室溫冷卻至50 ～60 ℃，傾倒于一次性培養皿中（大約20 mL），靜置至完全凝固，于4 ℃冰箱保存，備用（七天內用完）[15]。

（2）OD600的測定：復蘇菌株后，挑取單個菌落于經高壓滅菌的LB 培養液中，使用比濁儀調節菌懸液的麥氏單位為2.5，吸取200 μL 于96 孔板中，用酶標儀測OD600（LB 培養液做空白對照）。

（3）菌懸液的培養：取上述2 mL LB 菌懸液于24 孔板中，置于振蕩器上振蕩培養24 h（130 r/min，37 ℃）。

（4）OD520的測定：將24 孔板中的菌懸液吸取到滅菌EP 管中，經高速離心機12 000 r/min 離心5 min，取上清于滅菌試管中，加入3 mL 氯仿，吸打混勻，輕輕搖動萃取20 min；將下層溶液移入干凈的試管，加入1 mL 0.2 mol/L 的鹽酸，吸打混勻，輕輕搖動萃取20 min；取上層鹽酸溶液于96 孔板，酶標儀測OD520（空白對照為LB 培養液經雙相萃取后的鹽酸溶液）。

（5）活性計算。綠膿菌素活性=OD520/OD600。

1.3 觀察指標與評價標準

觀察正常組和缺陷組經不同濃度PQS（10 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L）和不同時間（1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d）誘導綠膿菌素活性的變化，以未進行PQS誘導的原始菌株的OD520/OD600值作為基值，高于或低于原始菌株的基值被認為促進或抑制綠膿菌素的活性。誘導前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的大小與質控菌株進行比較。實驗獨立重復三次。

1.4 統計學方法

用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，誘導前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較采用秩和檢驗，P＜0.05 認為差異有統計學意義；原始菌株經不同濃度PQS 和不同時間誘導對綠膿菌素活性的影響采用重復測量方差分析進行統計分析，P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 菌株的收集

從臨床分離得到符合條件的原始菌株共10 株，正常組和缺陷組各5 株，分別經不同濃度PQS 和不同時間誘導最終共保存160 株銅綠假單胞菌。

2.2 PQS 誘導前正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

PQS 誘導前正常組與缺陷組綠膿菌素活性比較的結果見表1，P=0.008，表明誘導前兩組的綠膿菌素活性差異有統計學意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性低于正常組，缺陷組的綠膿菌素活性低于PAO1。

表1 誘導前兩組綠膿菌素活性的比較

2.3 PA 經PQS 不同誘導方案后正常組和缺陷組綠膿菌素活性的比較

不同誘導方案下，正常組和缺陷組綠膿菌素活性結果如表2 所示，相關分析見2.3.1 和2.3.2。

表2 正常組和缺陷組經PQS 不同誘導方案綠膿菌素活性的組內比較

2.3.1 正常組與缺陷組組內比較

正常組與缺陷組經PQS 不同誘導方案綠膿菌素活性的組內比較見表3。結果表明，不考慮誘導濃度間的差異（即不同誘導時間下的活性均值），正常組在不同時間的綠膿菌素活性差異有統計學意義（P＜0.05），缺陷組活性差異沒有統計學意義（P＞0.05）；不考慮誘導時間之間的差異（即不同誘導濃度下的活性均值），正常組在不同誘導濃度下的綠膿菌素活性差異有統計學意義（P＜0.05），缺陷組活性差異沒有統計學意義（P＞0.05）。

表3 正常組和缺陷組經PQS 不同誘導方案綠膿菌素活性的組內比較

具體地，正常組隨誘導時間的延長綠膿菌素的活性不同程度地增加（除了誘導3 d 時活性較1 d 和2 d稍有降低），其中10 μmol/L 和80 μmol/L 的誘導濃度下差異顯著（P＜0.05），40 μmol/L 時差異不顯著（P＞0.05）；缺陷組在同一誘導濃度下隨誘導時間的延長綠膿菌素的活性變化不明顯（P＞0.05）。除了正常組在誘導3 d 時隨誘導濃度的增加綠膿菌素的活性變化有統計學差異（P＜0.05），兩組在同一誘導時間下隨誘導濃度的增加綠膿菌素的活性變化均不明顯（P＞0.05）。正常組和缺陷組的誘導時間與誘導濃度之間均無交互作用（正常組F=0.612，P=0.643；缺陷組F=0.919，P=0.446），表明兩組分別在不同PQS 誘導濃度下，綠膿菌素活性隨誘導時間的延長變化的趨勢相近。

2.3.2 正常組與缺陷組組間比較

正常組與缺陷組經不同誘導方案綠膿菌素活性的組間比較見表4，兩組菌株在誘導1 d、2 d、3 d、4 d 和5 d 時綠膿菌素活性差異均有統計學意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性均顯著低于正常組。兩組菌株在誘導濃度10 μmol/L、40 μmol/L 和80 μmol/L 時，綠膿菌素活性差異均有統計學意義（P＜0.05），缺陷組的綠膿菌素活性均低于正常組。

表4 正常組與缺陷組經不同誘導方案綠膿菌素活性的組間比較

3 結論與討論

銅綠假單胞菌導致的嚴重感染與其自身產生的毒力因子密切相關，毒力因子活性越強，引起的感染癥狀越嚴重。PA 的毒力因子主要受三個QS 系統，即以高絲氨酸內酯為信號分子的Las 系統、Rhl 系統和以喹諾酮類為信號分子的PQS 系統的調控。三個系統相互制約，構成一個錯綜復雜而又井然有序的調控網絡。Las 系統位于調控網絡的上游，由轉錄激活因子lasR 和信號合成酶lasI 組成，正向調控Rhl 和PQS系統；PQS 系統位于中間層級，起連接作用，可正調節rhlI、lasI基因的表達，又受Rhl 系統的負調節[7-9,16]。綠膿菌素的生成主要受Rhl 和PQS 系統的調控，PQS可直接上調phzA-G 操縱子的表達，促進吩嗪類的合成[17-18]，如DIGGLE 等[19]發現外源性PQS 能促進綠膿菌素的提前表達。本課題組前期研究[12]已表明，與誘導前相比，外源性PQS 不同誘導方案對銅綠假單胞菌綠膿菌素的活性有促進作用，但是只研究了基因正常的銅綠假單胞菌，可能忽略了內源性PQS 對綠膿菌素活性的影響。

研究表明，囊性纖維化患者臨床標本中經常出現的lasR缺陷突變株不產生或產生極少量的內源性PQS，部分突變株能生成綠膿菌素，甚至有研究顯示Las 系統對綠膿菌素的生成呈負向調控，PAO1 的lasR缺陷突變株比野生型菌株生成綠膿菌素的能力增強[2,10,13]。然而，本研究發現，誘導前lasR缺陷菌株的綠膿菌素活性低于正常菌株和PAO1，可能與菌株的來源有關，菌株所處的環境不同，相應的適應性改變也有所差異。缺陷菌株因無法激活Las 系統，影響中下游PQS 和Rhl 系統的功能，不利于綠膿菌素的生成。

本研究中兩組菌株經不同PQS 誘導方案綠膿菌素活性變化有差異，其中正常組菌株在不同誘導方案下綠膿菌素活性呈不同程度地促進，缺陷組菌株在不同誘導方案下綠膿菌素活性變化不明顯，缺陷組菌株綠膿菌素活性始終低于正常組。一方面說明lasR 可能在綠膿菌素的生成過程中發揮重要的作用，推測綠膿菌素的表達可能也受Las 系統調控；另一方面表明，PQS 信號分子雖然可促進綠膿菌素表達，但可能不是主要影響因素。對于這些推測尚需進行基因和蛋白水平的研究進一步驗證。