肝細胞癌中7-脫氫膽固醇還原酶表達的臨床意義

莫偉嘉，張楚月，韋京妤，張觀蘭，唐宇星，殷彬烔，黃潔莊，羅嘉嫄，蔣洪棉，陳罡，吳華裕

（1.廣西醫科大學 第一附屬醫院病理科，廣西南寧 530021；2.廣西醫科大學 第五附屬醫院/南寧市第一人民醫院病理科，廣西南寧 530021；3.廣西醫科大學 第五附屬醫院/南寧市第一人民醫院醫學實驗中心，廣西南寧 530021）

膽固醇作為構成細胞內各種膜結構的不可或缺的重要物質，對真核生物細胞的生長發育和行為調控具有重要的作用[1]。維持膽固醇在組織細胞內的動態平衡對于細胞正常生長發育極為重要[2]，膽固醇在細胞內失衡可致使疾病的發生，如在肝炎向肝細胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）發展的病理過程中，膽固醇的異常堆積有很大的推動作用[3]。有不少學者從不同的角度，描述了膽固醇對HCC 生物學行為的影響[4-6]。因此，發現膽固醇的潛在調節機制對于降低HCC 的發病風險、改變HCC 的生物學行為、改善HCC 的轉歸和預后、尋求有效的靶向干預措施等具有重要的臨床意義。

在膽固醇的合成過程中，作為關鍵酶之一，7-脫氫膽固醇還原酶（7-Dehydrocholesterol Reductase，DHCR7）扮演著重要的角色[7-8]。DHCR7 可將維生素D 前體物質轉化為膽固醇，以發揮調節膽固醇的作用。同時，有遺傳分析研究表明，25-羥維生素D（25-[OH]-D3）血清水平與丙型肝炎病毒（HCV）相關性HCC 具有相關性，而DHCR7 是調節25-[OH]-D3血清水平的決定性因素[9]。有分子機制研究表明，在（基因型2a）HCV 通過人肝癌細胞Huh7 中誘導出的人HCC 中，DHCR7 同時作為中樞基因和中樞節點存在，可能作為一種潛在的生物標志物對日本暴發性肝炎病毒（JFH-1）感染導致的HCC 的發生發展起到重要作用[10]。但如今還未見到探索DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 細胞中表達水平的相關報道，故本研究擬整合基因芯片、RNA 測序以及組織芯片數據，探索DHCR7 在HCC 的表達意義。

1 材料與方法

1.1 臨床數據收集

HCC基因芯片及測序數據來自ArrayExpress（https://www.ebi.ac.uk/biostudies/arrayexpress）、Gene Expression Omnibus（GEO，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）、Genotype-Tissue Expression（GTEx，https://www.gtexportal.org/home/index.html） 和The Cancer Genome Atlas Program（TCGA，https://www.cancer.gov/ccg/research/genomesequencing/tcga）。納入的公共隊列樣本數據須滿足以下條件：（1）研究對象為智人；（2）公共隊列數據需包含HCC 和正常肝臟組織；（3）樣本為組織層次；（4）數據集中須包含DHCR7 的表達數據；（5）公共隊列數據樣本不受任何物理、化學或其他因素的影響。排除原則為：（1）動物標本；（2）無DHCR7 表達值的數據；（3）重復標本。

1.2 DHCR7 mRNA 在HCC 組織中的表達情況

使用STATA 14.0 軟件評估DHCR7 mRNA 的標準化平均差值（Standardized Mean Difference，SMD）。I2為入組研究之間的異質性，I2＞50%或P＜0.05稱為高異質性，采用隨機效應模型；其余采用固定效應模型。為研究DHCR7 對HCC 組織的鑒別能力，計算總體受試者工作特征曲線（summary Receiver Operating Characteristics，sROC），得到曲線下的總面積（Area Under the Curve，AUC），并計算敏感性和特異性。Egger’s 與Begg’s 檢驗用于判別合并結果是否具有發表偏倚，P≥0.05 提示結果不具有顯著的發表偏倚。

1.3 DHCR7 蛋白在HCC 中的表達水平

利用人類蛋白質圖譜（The Human Protein Atlas，THPA）獲取DHCR7 蛋白在HCC 和非癌肝組織的表達情況，并進行比較。

2 結果與分析

2.1 DHCR7 在HCC 及非癌肝對照組織中的mRNA表達水平

最終從上述數據庫中獲得了7 384 份樣本，包括3 941 份HCC 樣本和3 443 份對照樣本。為明確DHCR7 mRNA 在HCC 中的表達水平，整合納入數據集計算DHCR7 mRNA 表達量的SMD 值。由于I2＞75%且P＜0.01，研究采取隨機效應模型，計算得出SMD 為0.35，95%置信區間（95%CI）為0.20 ～0.51（圖1）。SMD 結果的Egger’s 檢驗P值為0.521，Begg’s 檢驗P值為0.400，均顯示P＞0.05，圖像也顯示了一種對稱的形式，即總體上并不存在明顯的偏倚（圖2）。結果初步顯示，DHCR7 mRNA 表達在HCC 中顯著增多。

圖1 HCC 和對照組織中DHCR7 mRNA 表達森林圖

圖2 SMD 結果的檢驗漏斗圖

2.2 HCC和非癌肝組織DHCR7 mRNA表達的sROC曲線結果

經過進一步計算，總特異性（specificity）、總敏感性（sensitivity）分別為0.81（95%CI：0.74～0.87）與0.60（95%CI：0.50 ～0.65）（圖3）。最后，基于各數據的綜合計算，sROC 曲線擬合AUC 為0.77（95%CI：0.73 ～0.81）（圖4），這進一步證實了HCC 組織中DHCR7 mRNA 表達的上調。因此，DHCR7 具有鑒別HCC 的潛力。

圖3 HCC 組織DHCR7 過表達的判別結果

圖4 具有預測與置信區間的集成工作特性曲線（sROC）

2.3 DHCR7 蛋白在HCC 中表達趨勢

DHCR7 蛋白在細胞質及細胞膜上表現為陽性信號。如圖5 所示，HPA 數據庫中DHCR7 蛋白在健康肝臟切片中弱染色，但在HCC 中強染色，說明DHCR7 在HCC 中的表達顯著高于健康肝臟（P＜0.05）。AUC 值為0.77，進一步支持了DHCR7 蛋白在HCC 組織中明顯過表達的發現（圖4）。

圖5 HCC 與非癌肝組織中DHCR7 蛋白表達水平的免疫組化圖

3 結論與討論

本研究第一次探索了DHCR7 mRNA 及蛋白在HCC 中的表達情況，并對其進行了相關的拓展研究。通過來自TCGA、GEO、GTEx、ArrayExpress 等權威數據庫的數據集、RNA 測序結果以及組織芯片數據等途徑，揭示了HCC 組織中DHCR7 的mRNA 轉錄和蛋白翻譯水平的上調，涵蓋了廣泛的種族和人群。

本次研究最主要的發現是DHCR7 在HCC 中過度表達，這意味著DHCR7 可能是HCC 潛在的靶向標志物，為未來HCC 的診斷、治療、預后預測等臨床需求指出一條新的方向。

近年來，在某些實體腫瘤中，DHCR7 的高表達已經引起一些學者的注意。例如，有研究者稱，DHCR7 在宮頸癌（Cervical Carcinoma，CCA）中的過表達可能導致CCA 的低生存率[11]。還有學者發現，DHCR7 作為一個獨立的危險因素在膀胱癌中表達上調，并且與其分級和分期相關，最終可導致預后不良[12]。此外，有研究結果表明，由于DHCR7 基因對循環維生素D 水平的影響，多態性可能與甲狀腺癌風險增加有關[13]。而在對胃癌的研究中，也有學者稱DHCR7 基因的突變抑制了胃癌細胞的惡性行為，并通過抑制細胞膽固醇生物合成誘導凋亡[14]。作為脂質代謝相關基因，DHCR7 也被發現影響著頭頸部鱗狀細胞癌的臨床特征，譬如分期、性別和病理分期等[15]。即便在未知部位原發癌（Cancer of Unknown Primary，CUP）的全基因組關聯研究中，也發現DHCR7 作為編碼膽固醇和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）合成中的關鍵酶與CUP 的肝轉移有一定關聯[16]。這說明DHCR7 的表達異常，可能在多種腫瘤的進展途徑中責任重大。

當然，HCC 作為全球發病率最高的癌癥之一，研究其與DHCR7 相關性的文章近年也不斷涌現，然而筆者發現，這些文章多是從膽固醇或維生素D 的代謝角度對肝癌的發生進行研究與分析，繼而發現DHCR7 作為膽固醇與維生素D 代謝過程中的關鍵基因/酶與HCC 甚至肝臟疾病的關聯性，且涵蓋了HCC 從發生、發展到預后的各個臨床階段的研究。譬如，在發病風險方面，有研究通過脂代謝相關基因分析發現了維生素D 在HCV 相關性HCC 的發病風險中存在一定的作用，而DHCR7 在其中的作用不可忽視[9]。在基因調節方面，有研究通過功能富集分析發現，在由JFH-1 誘導出的丙型肝炎發展而成的HCC中，下調共調控基因與膽固醇代謝相關，DHCR7 正是其確定的中樞基因之一，并可能成為JFH-1 相關的HCC 的候選生物標志物[10]。在肝臟疾病的預后方面，有研究稱，維生素D 代謝和VDR（維生素D 受體）-TGFβ-1（轉化生長因子β-1）-SMAD3（Sma和Mad 相關蛋白）相互作用的潛在遺傳變異可能影響丙型肝炎的進展，導致肝臟失代償、纖維化、惡化、HCC 發展和肝臟死亡等不良預后，從而進一步發現，DHCR7 作為維生素D 代謝中的關鍵酶，4 個單核苷酸多態性（SNPs）與肝臟失代償相關的結局有關，而肝臟失代償與肝癌的發生密不可分[17]。

與眾不同的是，本研究直接關注了DHCR7 與HCC 的關系，直接提供了DHCR7 在HCC 中存在過表達的證據，發現DHCR7 可能是導致HCC 發生的獨立因素。然而，由于本研究還未在HCC 患者的血液中檢測DHCR7 水平，其在HCC 的早期篩查中的作用仍須更進一步的研究。同時，DHCR7 的高表達也導致一些HCC 患者的預后較差，但這一發現需要未來用更多的樣本進行驗證。總之，這是第一項直接評估DHCR7 在HCC 中可能的臨床價值的研究。

至于DHCR7 在誘導HCC 發生中發揮作用的主要機制，現有的研究表明，在基因相關性研究和功能與途徑富集分析中，均找到了DHCR7 與HCV 誘導的HCC 具有相關性的證據[9-10]。本文直接揭示了DHCR7 在HCC 組織中mRNA 水平的升高和蛋白質的過表達，為DHCR7 與HCC 相關性研究中的證據鏈補充了重要的一環。

有趣的是，在過去發現DHCR7 與HCC 的發病風險、發展及預后等臨床表現存在相關性的文章中，被研究的對象多為HCV 誘導發生的HCC，即HCC 的原發疾病被限定為丙型肝炎，而DHCR7 參與調節HCC發生發展的方式是作為維生素D/膽固醇代謝的關鍵基因[9-10,17]。然而在另一些研究對象不限于HCV 相關性HCC（如酒精性脂肪性肝病、非酒精性脂肪性肝病、乙肝病毒等導致的HCC）的文章中，也得出了異常膽固醇/維生素D 代謝影響HCC 發生、發展、轉歸等方面的結論[3,18-19]。與此同時，本文發現，在不同原因導致的HCC 中，都能發現DHCR7 的過表達。因此，通過合理推測，DHCR7 作為調節膽固醇/維生素D 的關鍵基因對于HCC 發生發展的調節作用，廣泛存在于不同原因導致的HCC 中。未來對于DHCR7在HCC 中分子機制的研究，不應當將研究對象局限于HCV 相關性HCC，而應當對不同肝臟原發病導致的HCC 進行廣泛研究，尤其是增加對非HCV 相關性HCC 的研究，以找到其中共同的分子機制以及幾者之間的不同之處，豐富DHCR7 在HCC 中的相關性研究，發掘DHCR7 作為HCC 治療靶點的潛力。

本研究不可避免地有其局限性。雖然獲得了DHCR7 在HCC 過表達的mRNA 和蛋白組學證據，然而DHCR7 的生物學功能和相關的生物分子途徑尚未通過各種對比實驗在HCC 中得到驗證。未來，必將需要更完整、更具體的工作來解釋DHCR7 在HCC 的確切作用機制。